依达拉奉对aβ140诱导pc12细胞nfκb、bcl2 mrna和蛋白表达的影响

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1、依达拉奉对Aβ140诱导PC12细胞NFκB、Bcl2mRNA和蛋白表达的影响【摘要】目的探讨依达拉奉对β淀粉样蛋白(Aβ140)诱导PC12细胞NFκB、Bcl2mRNA和蛋白表达的影响。方法采用Western印迹法，RTPCR等检测NFκB、Bcl2mRNA和蛋白的表达,观察MCI186对其保护作用。结果模型组中NFκBP65mRNA和蛋白表达水平明显升高，Bcl2mRNA和蛋白表达水平明显降低，与对照组比较有显著差异(P<0.01)。保护组中NFκBP65mRNA和蛋白及Bcl2mRNA和蛋白表达与模型组

2、组间比较有统计学意义(均P<0.05)，而与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。结论Aβ140可以活化神经细胞内NFκB，减少Bcl2的表达，发生细胞凋亡。依达拉奉可以抑制NFκB激活，增加Bcl2的表达发挥抗凋亡作用，最终达到保护神经细胞的目的。【关键词】依达拉奉;NFκB;Bcl2;阿尔茨海默病;细胞凋亡阿尔茨海默病(AD)是老年人最常见的神经变性疾病,临床表现为进行性痴呆、认知障碍和行为异常。目前资料表明，AD的发生与氧化应激密切相关，氧化应激增加蛋白质氧化损伤和DNA氧化损伤，导致神经元死亡或功能失调，而这

3、种缺失死亡以凋亡为主。9　　依达拉奉是新型的自由基清除剂，可以特异性清除羟自由基(OH)，抑制氧化应激及其继发的细胞凋亡，发挥神经保护作用，目前主要应用在脑梗死早期和脑出血的治疗中。临床发现依达拉奉对部分痴呆患者可能有改善症状的作用，提示依达拉奉是一种具有前途的治疗AD的药物。本实验通过Aβ140蛋白诱导损伤的PC12细胞建立AD细胞模型，探讨NFκB、Bcl2与神经细胞凋亡的关系，为进一步研究AD的发病机制及防治策略提供理论基础。　　1材资料与方法　　1.1药品与试剂PC12细胞购自中国生命科学院上海细胞所，Aβ140、NFκB引

4、物、Bcl2引物、βactin引物、NC膜、TEMED购自北京鼎国生物公司,NFκBP65抗体、Bcl2抗体购自Sigma公司，DAB显色试剂盒购自博士德公司,依达拉奉购自江苏先声药业有限公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养和预处理用含有15%胎牛血清的DMEM培养基(3.7gNaHCO3)，置于37℃，5%CO2孵箱中培养，每3天传代1次，传代时用机械方法吹打贴壁的PC12细胞，取生长期细胞用于实验。分为依达拉奉保护组(20μmol/L依达拉奉+Aβ140)，Aβ140模型组(30μmol/LAβ140)和对照组(正常PC

5、12细胞)。9　　1.2.2目的基因mRNA的表达Trizol法提取总RNA。紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，28S/18S灰度比约为2∶1。　　1.2.3逆转录PCR(RTPCR)法首先mRNA反转录合成cDNA第一链。以上述cDNA为模板，以βactin为内参照，分别对NFκBP65和Bcl2进行PCR扩增。大鼠βactin引物：上游引物：5′ATTTGCACCACACTTTCTACA3′，下游引物：5′TCACGCACGATTTCCCTCTCAG3′(扩增长度380bp)。大鼠NFκBP65引物：上游引物：5′A

6、AGATCAATGGCTACACAGG3′，下游引物：5′CCTCAATGTCTTCTTTCTGC3′(扩增长度493bp)。大鼠Bcl2引物：上游引物：5′CTGGTGGACAACATCGCTCTG3′，下游引物：5′GGTCTGCTGACCTCACTTGTG3′(扩增长度441bp)。　　1.2.4Western印迹检测NFκBP65、Bcl2蛋白表达常规蛋白质提取。采用Bradford(1976)法进行蛋白质定量抗体结合，将封闭的膜浸泡在含有一抗的反应液中，37℃，2h;将洗涤后的膜加入含有二抗的反应液中，37℃，2h

7、;TBST洗液15ml洗膜，10min×3次;显色照相：洗涤后的膜加入1mlDAB显色液，显色10～30min，用水漂洗终止显色，湿润密封4℃保存，待照相记录后，分析结果。　　1.3统计学分析所有数据均采用x±9s表示，应用SPSS13.0统计软件对各组NFκBP65mRNA和Bcl2mRNA相对水平进行Studentt检验。　　2结果　　2.1NFκBP65mRNA和Bcl2mRNA的表达模型组中NFκBP65mRNA表达水平明显升高，Bcl2mRNA表达水平明显降低，与对照组比较有显著差异(P<0.01)，说明Aβ14

8、0能引起PC12细胞NFκBP65mRNA表达上调，Bcl2mRNA表达水平减低，促进细胞凋亡。保护组中NFκBP65mRNA及Bcl2mRN