去卵巢大鼠海马及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽含量的变化

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1、去卵巢大鼠海马及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽含量的变化作者：高飞宋士军胡进中李芳芳张若楠【摘要】目的观察雌激素缺乏对大鼠海马CA1/CA2区及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽（HP）含量的影响。方法选取清洁级4月龄雌性SD大鼠30只，随机分为3组：假手术组（Sham组）、去卵巢组（OVX组）和去卵巢加雌二醇（E2）组（OVX+E2组），每组10只。除Sham组做假性手术外，其余2组均行双侧卵巢切除术；OVX+E2组去卵巢手术10d后给予E2皮下注射，100μg/kg，隔日1次。去卵巢手术后常规喂养4个月，获取组织标本，用于组织蛋白和组织总RNA的提取。用etho

2、dsThirtyfemalecleanSDratsaged4monthslydividedintosham,OVX,OVXandestradiol(OVX+E)groups,andtenratspergroup.Shamgroupeadiposetissueaboveovaries,OVXgroupy.Postoperativeratsethodandthensacrificed4monthslatertoobtaintissuesandspecimenfortheuseoftheextractionoftissues’protEinandtotalRNA.

3、TherelativeprotEIncontentsofCHPppandNHPppeasuredbyilipore公司）；HPpp氨基末端抗体（NHPppAb）、HPpp羧基末端抗体（CHPppAb）、βactin抗体、免疫印迹发光染料(ECL)（美国SantaCruz公司）；辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥公司）；β巯基乙醇（美国Promega公司）；TaqDNA聚合酶（美国Fermentas公司）；dNTP（北京鼎国生物公司）；反转录试剂盒（美国Fermentas公司）；HPppmRNA、β

4、actin引物（上海生工公司）。其余试剂均为国产优级纯或分析纯。1.3仪器设备DYYⅡ型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；20PR52D型低温高速离心机（日本日立公司）；PTC200型PCR热循环仪（美国MJResearch）；JEDA801E型捷达凝胶成像仪（江苏捷达软件公司）。1.4组织标本的采取及指标测定用戊巴比妥钠(36mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，剪开头皮，用止血钳沿大鼠头颅中央骨缝撬开，迅速分离脑组织，剥取海马，同时刮除腹侧齿状回和CA3区，剥取额叶皮层，立即将海马背侧组织(CA1/CA2)及额叶皮层置液氮中，于-80℃低温冰箱保存，用于

5、组织蛋白和组织mRNA的提取。分离大鼠子宫并进行称重。1.5组织蛋白的提取取大鼠海马背侧组织及额叶皮层各约50mg，加入预冷的蛋白匀浆液0.5ml，在冰浴中匀浆5min，4℃离心10000r/min离心30min，取上清，Bradford法测定蛋白含量。1.6HPpp蛋白的测定采用in。取膜TBS冲洗。用TBS配制5%脱脂奶粉，室温封闭4h。用5%的BSA按比例稀释一抗(CHPpp1∶1500；NHPpp1∶1500；βactin1∶2000)，向膜的正面滴加一抗，4℃过夜(防止液体蒸发)。回收一抗后，用0.05%Tin。用5%的BSA按1∶6000

6、稀释二抗，滴加二抗，室温静置2h。用0.05%Tin，最后用TBS洗膜5min，在暗室滴加ECL试剂反应3min，保鲜膜包裹置于暗盒中进行X光胶片曝光、显影和定影。用凝胶成像分析仪采集图像并用软件进行分析。βactin作为内参照。1.7HPmRNA表达的测定用Trizol法提取总RNA。将含1.0μgRNA的水溶液和随机引物置于0.2ml的微量离心管中，70℃变性5min，立即置于冰水浴中。加入反应体系中的其他成分混匀，25℃15min，42℃孵育60min，70℃10min，置冰水浴冷却，得到cDNA，-20℃保存备用。PCR引物序列如下：HPpp（基因

7、文库：NM_017236）：上游：5′ACTACGGCGGAGTAACGG3′，下游：5′GCTTGGGCACAGAGTCATC3′，长度456bp；βactin（基因文库:NM_031144）：上游：5′GCCATGTACGTAGCCATCCA3′，下游：5′GAACCGCTCATTGCCGATAG3′，长度375bp。HPpp、βactin基因扩增条件均为94℃2min；94℃45s；56℃45s；72℃60s；72℃5min，循环28次。取HPpp和βactinPCR产物各5μl，用2%琼脂糖凝胶进行电泳，将结果用凝胶成像系统照相

8、，分析扩增产物的积分光密度值（I），计算二者的比值（