大鼠海马锥体神经元延迟整流钾电流的发育变化论文

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1、大鼠海马锥体神经元延迟整流钾电流的发育变化论文【摘要】目的研究大鼠海马锥体细胞延迟整流钾电流（IK）在出生后不同发育阶段的变化。方法采用膜片钳全细胞记录模式比较3个不同年龄组，即出生后7～10天（P7-10组）、25～30天（P25-30组）和56～60天（P56-60组）ethodsgSO42，NaHCO326，葡萄糖10，CaCl22，pH7.20〕，于冰盒上分离海马，并将海马切成400～500μm的薄片（冠状切片），随后将脑片移入充氧的ACSF内孵育1h，将脑片移入充氧的含0.05%胰蛋白酶的恒温（32℃

2、）ACSF内酶解30min，以正常充氧的ACSF冲洗2～3遍，然后将脑片移入充氧的含0.05%蛋白酶E的恒温（32℃）ACSF内酶解30min，以正常充氧的ACSF冲洗2～3遍，即可将脑片置于室温充氧的ACSF中保存。在开始膜片钳实验前，取1～2片脑片移入2mlACSF中，以火抛光的Pasteur吸管（500、300、150μm）顺序吹打，静置10min，取上清经金属网过滤加入细胞池内，静置15～20min，于显微镜下可见大量的单个海马锥体神经元。1.3膜片钳全细胞模式记录以台氏液〔成分（mmol/L）：氯化胆

3、碱120,KCl6,MgCl210,葡萄糖20,HEPES10,以KOH调节pH至7.30〕灌流分离好的细胞，流速1.5ml/min。玻璃微电极（原料GG17，外径1.5mm，中国科学院上海脑研究所提供）由PP-83型拉制仪（日本Narishige公司）分两步拉制，充灌电极内液〔成分（mmol/L）：KCl140，MgCl20.5，EGTA10，HEPES10，以KOH调节pH至7.20〕后电阻为4～5MΩ。选择细胞表面光滑、细胞内无颗粒、无空泡的健康锥体细胞，采用高阻封接技术，负压破膜，形成全细胞记录。EPC

4、-9型膜片钳放大器（德国HEKA公司）通过ITC-16连接IBM微型计算机，应用PULSE程序进行刺激发放和信号采集，结果存于计算机内，以备分析。1.4电流记录和分析方法破膜后细胞膜电位钳制在-50mV，首先超极化至-110mV，持续150ms，然后除极到-50mV，持续50ms，随后以步长10mV的阶跃刺激从-50mV至+40mV除极150ms，测量每次阶跃除极刺激末端（150ms）处的电流，即为IK电流。采用GPIP软件，以Boltzmann方程拟合稳态激活曲线：G/Gmax=1/{1+exp［-（V-V1

5、/2）/k］}，其中G/Gmax是通道的电导百分数，V为去极化膜电位，V1/2是半数最大激活膜电位，k为斜率因子。1.5给药系统采用美国ALA公司的BPS-4灌流系统给药，控制流速为1～1.5ml/min，灌流液温度维持在室温（22～24℃）。ACSF、台氏液及药物均在实验当天配制。其中四乙铵（TEA）、4-氨基吡啶（4-AP）、胰蛋白酶、蛋白酶E、HEPES、EGTA为Sigma公司产品，其余试剂均为国产分析纯。1.6统计学处理所有数据均以±s表示，采用两样本均数的t检验进行统计学处理，P0.05为差异有显著

6、性。2结果2.1IK电流的记录及发育变化采用氯化胆碱完全取代灌流液中的Na+，以排除Na+电流的干扰。在所研究的3组动物海马锥体细胞中，均可记录到IK电流。图１显示发育过程中IK电流幅度的变化。当除极到+30mV时，3个年龄组海马IK峰值电流密度、电流幅度及细胞膜电容的变化见表１，可见随年龄增大，IK电流幅度及密度均上调，而P25-30和P56-602组间未见显著性改变。2.2IK电流的激活动力学变化根据所记录到的IK电流，研究了出生后发育过程中海马锥体神经元IK电流的稳态激活动力学的变化，结果表明随年龄增大，

7、IK的稳态激活曲线左移，其半数最大激活电位（V1/2）由-12.2mV逐渐增加到-17.8mV，而斜率因子基本不变（图2、表2）。不同年龄组的V1/2和k值比较见表2。2.3IK电流药理学特征的变化利用钾电流对TEA和4-AP敏感性的不同可以区分不同亚型的电压依赖性钾通道。我们研究了3个年龄组海马锥体神经元IK对不同浓度TEA和4-AP的敏感性，以探讨在发育过程中是否有钾通道亚型的变化。图3显示TEA可剂量依赖性地抑制P7-10、P25-30、P56-603个年龄组的IK，其中P7-10组的IK对低浓度的TEA

8、（2和5mmol/L）较P25-30及P56-60组更敏感，而20mmol/L的TEA对3个年龄组动物的IK抑制百分率基本一致,均可抑制约60%。4-AP也可抑制IK，但未见剂量依赖性，1mmol/L的4-AP对3组动物所记录的IK均可抑制约20%；而2及5mmol/L的4-AP对IK电流抑制效应无明显增强（图4）。表1不同年龄组大鼠海马神经元IK电流密度的变化表2不同年龄组大鼠海马神