铜绿假单胞菌i类整合子相关基因的解析和定位

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1、铜绿假单胞菌I类整合子相关基因的解析和定位作者：杨维青贾文祥殷长甫刘贵霞黄震【摘要】目的对4株铜绿假单胞菌临床菌株携带的I类整合子相关基因进行解析和定位，探讨I类整合子相关基因在细菌耐药性形成和耐药基因播散中的作用。方法采用PCR扩增、DNA测序、DNA序列比对的方法对4株铜绿假单胞菌临床菌株携带的I类整合子相关基因进行解析，采用接合试验对该类整合子进行定位分析。结果4株铜绿假单胞菌I类整合子都含有耐药基因，该耐药基因在相应菌株中发挥耐药作用；该菌整合子位于质粒上。结论I类整合子耐药基因在铜绿假单胞菌耐药性形成和耐药基因的播散中发挥作用。【关键词

2、】铜绿假单胞菌；I类整合子；耐药基因ABSTRACTObjectiveDrugresistancegenesassociatedonasaeruginosainethedrugresistancegenesassociatedentsandtheconjugationsethod.ResultsFourclinicalstrainsofP.aeruginosacarrieddrugresistancegenesassociatedid.ConclusionDrugresistancegenesassociatedidonasaeruginosa;

3、ClassIintegron;Drugresistancegene整合子(integron，int)是一种细菌基因捕获和表达的遗传单位，它在细菌多重耐药的形成和耐药基因的水平播散中的作用引起了研究者的广泛关注［1～3］。整合子通过整合酶从环境中捕获耐药基因盒，并将耐药基因盒组装在一起，形成巨大的耐药基因多基因座；同时整合子及耐药基因盒可借助转化、转导及接合等方式在细菌中转移，使耐药基因广泛传播。整合子携带的耐药基因遗传稳定性较高、不易丢失，有利于细菌耐药基因的积累，在细菌多重耐药性的形成中起重要作用。I类整合子在铜绿假单胞菌中分布广泛［2～4］，

4、本文对铜绿假单胞菌临床分离株携带的I类整合子相关基因进行解析与定位，以期进一步探讨整合子在细菌耐药中的作用。1材料和方法1.1菌株已鉴定4株铜绿假单胞菌临床菌株(PA107、PA113、PA114和PA215)携带I类整合子及整合子相关基因盒(本实验室保存)。质控菌为铜绿假单胞菌ATCC27853(购自中国药品生物制品检定所)。对利福平耐药的整合子阴性大肠埃希菌RG488。1.2药敏试验选用10种常用抗生素(哌拉西林、头孢哌酮、头孢曲松、妥布霉素、庆大霉素、链霉素、左氧氟沙星、复方磺胺甲口恶唑和利福平)，按照美国临床实验室标准化研究所2000年版

5、纸片扩散法，对上述4株铜绿假单胞菌进行药敏试验。质控菌铜绿假单胞菌ATCC27853与检测菌株平行进行药敏试验。1.3铜绿假单胞菌I类整合子相关基因盒DNA序列分析(1)DNA模板的制备将上述4株铜绿假单胞菌分别接种于LB培养基中37℃过夜培养；取菌液50μl，悬浮在450μl双蒸水中，沸水浴10min后立即放至冰中冷却，稍后离心，上清液为粗提DNA，-80℃保存。(2)I类整合子相关基因盒扩增和测序以I类整合子两端高度保守序列设计引物(5′-GGCATCCAAG-CAGCAAGC-3′和5′-AAGCAGACTTGACCTGAT-3′)，扩增上

6、述4株铜绿假单胞菌I类整合子的可变区(包含整合子相关基因)。PCR反应体系为10×PCR缓冲液5μl、dNTP(均为2.5mmol/L)4μl、in-F和in-B各3μl、rTaq(5U/μl，TAKARA生物工程公司)0.25μl、模板DNA2μl，加无菌双蒸水至50μl。PCR条件：94℃变性5min；94℃30s，52℃1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸7min。使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒提纯上述PCR产物，并将其在ABIPRISM310测序仪上进行双向测序(委托上海生工生物工程有限公司完成)。(3)I类

7、整合子相关基因盒DNA序列分析通过.ncbi.nlm.nih.gov网站，登陆美国国家生物技术信息中心GenBankDNA数据库，应用StandardnucleotidenucleoticBLAST软件对所测得的上述4株铜绿假单胞菌I类整合子相关基因盒的DNA序列进行同源性比对分析，用DNAStar5.0软件对DNA序列进行开放读码框(openreadingframe，ORF)分析，确定整合子基因盒中所含的耐药基因。1.4I类整合子的定位(1)接合转移试验以对利福平耐药的整合子阴性大肠埃希菌RG488(E.coliRG488，Rifr+)做受体菌

8、，以上述整合子耐药基因明确的4株铜绿假单胞菌做供体菌，进行接合转移试验。根据供体菌的耐药表型和所携带的整合子相关耐药基因的特性，确定与其