铜绿假单胞菌氨基糖苷类耐药基因的研究

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1、万方数据温州医科大学硕士学位论文答辩委员会主席：塑松生答辩委员会成员：里主渲匿筮韭万方数据温州医科大学硕士学位论文目录j}爸：；ej·-·········································································1中文摘要⋯⋯··⋯⋯⋯·⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯·7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11结

2、果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37，J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48综述参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58万方数据温州医科大学硕士学位论文铜绿假单胞菌氨基糖苷类耐

3、药基因的研究中文摘要目的：本文应用高通量测序以及基因组生物信息分析，以临床分离的不同年份的铜绿假单胞菌(PA)为研究对象，研究已经报道过的所有氨基糖苷类耐药基因在PA中的分布情况；并发掘PA中氨基糖苷类耐药新基因型，克隆候选基因，通过药敏试验来验证新基因型的功能。进一步对该基因进行生物信息学分析，为铜绿假单胞菌所携带的耐药基因分布规律、传播机制研究打下基础。方法：本课题以温州医科大学附属第一医院临床分离得到的239株PA为样本，提取其混合基因组，并送至北京中科院基因组研究所进行solexa测序。通过一系列生物信息学工具，将测序得到的短序列与收集到的151条己报道氨基糖苷类耐

4、药基因序列比对分析，研究这151条氨基糖苷类耐药基因在PA中的分布情况及丰度差异。同时进一步发掘新的耐药基因型，选取其中的aadA4基因型为代表，设计引物PCR定位该基因所在的菌株。PCR筛选出的阳性菌株中的aadA4基因，对其进行生物信息分析，研究该基因的同源性和分子进化。将aad,44新基因型片段连接到T载体，转入大肠杆菌JMl09，提取重组子质粒进行双酶切，再将片段连接到pET-15b载体，转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21，涂布于含Amp平板上进行培养，筛选阳性菌株pET：：aadA4／BL21。然后通过琼脂倍比稀释法测定pET：：aadA4／BL21对17种药物的M

5、IC值，来验证铜绿假单胞菌中aadA4新基因型的功能。同时药敏试验也研究了选取的45株铜绿假单胞菌对17种药物的MIC值，观察该院分离的铜绿假单胞菌的对抗生素的耐药性情况以及分析aadA4基因阳性株与阴性株耐药性的差异。结果：1．铜绿假单胞菌混合基因组高通量测序结果产生的短序列reads总数有70，239，195条，reads的长度均为100nt。将reads比对到151条氨基糖苷类耐药基因序列上，最后发现有25个基因型存在于铜绿假单胞菌中。其中丰度最高的基因型为aphO=)．册，丰度有1636．218X，覆盖度99．88％；丰度最低的基因型是aad,412，丰度有2．2X

6、，覆盖度80．1％。万方数据温州医科大学硕士学位论文2．从239株铜绿假单胞菌中，PCR筛选出两株菌TLl229、TLl285，包含有aadA4基因型，其余铜绿假单胞菌均不含aadA4基因型。3．PCR产物测序结果分析，TLl229与TLl285中的aadA4基因型比对identity为100％，TLl229、TLl285中的aadA4基因型与参照序列aadA4比对identity为95％，且发生了氨基酸水平的差异。4．aadA4新基因型进行进化树分析，发现与大肠杆菌中的YP190214蛋白亲缘关系最近，铜绿假单胞菌中aadA4基因的来源可能是由大肠杆菌水平转移而来。5．成

7、功将aadA4基因连接到pET．15b表达载体，并成功构建表达目的重组菌pET：：aadA4／BL21。6．MIC功能验证，TLl229、TLl285中发现的aadA4新基因型对链霉素、大观霉素和新霉素的MIC值比对照组高出4个浓度梯度左右，对其他抗生素则没有明显的作用。7．医院分离的铜绿假单胞菌对链霉素、大观霉素、核糖霉素、头孢唑啉钠、氨苄西林钠和替卡西林具有很强的耐药作用，MIC值达到了1024pg／mL以上。TLl285、TLl185、TLl208、TLl288、TLl289这五株菌几乎对所有的药物MIC都很