velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株u266细胞凋亡研究论文

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1、Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究论文.freelol/Lvelcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基（ROS），用半定量RT-PCR法检测bcl-2mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖；诱导U266细胞凋亡.freelaCellLineU266ApoptosisInducedbyVelcadeAbstractToinvestigatetheeffectofvelcadeonmultiplemyelomacelllineU266apoptosisanditsme

2、chanism，cellviabilityatedbytrypanbluedyeexclusion.Annexin-V，mitochondrialtransmembranepotential(Δψm)andreactiveoxygenspecies(ROS)labeledbyDCFHDAinedbyfloetry，theexpressionofbcl-2mRNAi-quatitativeRT-PCR.Theresultsshoorphologiccharacteristicsofapoptosis.Velcadeat50nmol/LincreasedAnnexinVp

3、ositivityandfluorescenceintensityofDCFbecauseofROSgenerationofU266cells.Expressionofanti-apoptoticgenebcl-2mRNAalsodecreased.Itisconcludedthatvelcadeinhibitethegroultiplemyeloma;apoptosis多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤，多发生于老年人。随着社会人口的老龄化，其发病率呈逐渐增高的趋势。几十年来对MM一直采用激素和细胞毒性药物联合治疗，尽管近年来加用反应停抑制

4、血管新生治疗或采用自体骨髓移植治疗，但其仍是一种不可治愈的血液系统肿瘤。由此可见，开发新的治疗方法有重要的临床价值。蛋白酶体抑制剂近年来作为MM新的治疗制剂用于临床试验，本研究就临床新药蛋白酶体抑制剂velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞的凋亡作用进行探讨。材料和方法细胞培养U266细胞置于含10%的热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液（Gibco公司产品）中，于37℃、5%CO2和95%空气湿度条件下进行培养。实验过程中，细胞以（2-5）×105细胞/毫升的密度接种培养，并与不同浓度velcade一起进行孵育，对照加DMSO。细胞活率由台盼蓝拒染法检测，

5、根据处理组存活细胞数与死细胞数的比例来计算。形态学观察，细胞用cytospin(Shandon，Runcorn，UK)收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。每次试验重复3次。生长抑制率及细胞活率按如下公式计算：生长抑制率＝［(对照组细胞数-处理组细胞数)／对照组细胞数］×100%存活率＝［活细胞数／(活细胞数＋死细胞数)］×100%Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基（ROS）的流式细胞仪分析Annexin-V分析使用FITC标记的AnnexinV和PI双染法检测细胞凋亡，根据BectonDickinsonBiosciences公司提供

6、的说明书进行操作。简单地说，取（1-2）×105细胞，经PBS漂洗后加100μl结合缓冲液，重悬细胞，加5μlAnnexinV-FITC，10μlPI避光孵育15分钟后加400μl结合缓冲液，用流式细胞仪检测。线粒体跨膜电位(Δψm)检测取5×105细胞，用PBS清洗1次，加入10μg/mlRh123（Sigma公司产品）37℃孵育30分钟，用PBS漂洗1次，加入终浓度10μg/mlPI4℃暗处放置30分钟，用流式细胞仪检测。活性氧测定细胞内活性氧测定方法参照文献［1］方法进行，DCFHDA(Sigma公司产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH，在活性氧存在下

7、被氧化成DCF，DCF荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF的激发波长为485nm，吸收波长为530nm。将药物处理的细胞（1×105）经过PBS洗涤，重悬于1ml含有10μmol/LDCFHDA的PBS中，以未加染料的样品作为对照，37℃孵育20分钟，以PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测5000个活细胞的荧光强度。velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266bcl-2mRNA表达的半定量RT-PCR检测细胞总RNA抽提收集3×106细胞，用TRIzoL试剂（GibcoBRL产品）按说明书抽提细胞总RNA。cDNA合成及PCR扩增方法参见文献［2］，