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1、表没食子儿茶素没食子酸酯测定及其对胃癌细胞增殖的抑制作用研究论文张凤，安利国，李福荣，赵晓民，文今福，杨桂文【摘要】目的分析表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在绿茶提取物中的含量，探讨EGCG对人胃癌细胞BGC823增殖和凋亡的影响，为阐明EGCG抗肿瘤作用机制提供实验基础。方法反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定绿茶提取物中EGCG的含量。MTT法检测EGCG对体外培养的人胃癌细胞BGC823增殖的影响;DNAladder法检测EGCG处理各组DNA梯度的变化。所有数据均采用SPSS12.0进行
2、统计分析.freelangastriccancercellsBGC823culturedinvitro,entalbasisforclarifyingthemechanismofantitumoreffectofEGCG.MethodsIntheconditionofmobilephasedoubledistilledl/min,RP-HPLCChromatogramangastriccancercellsBGC823culturedinvitroofthecellsineachgroupinedbyM
3、TTmethod.DNAladderassayedbySPSS12.0andttesteanvaluebetenteasuredbyMTTassay,cellviabilitydecreasedinadose-(5×10-3,1×10-2,2×10-2,4×10-2g/L)dependentmanner(shoa公司);RPMI1640干粉(GIBCO);小牛血清(四季青生物工程材料有限公司);噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);青霉素(北京鼎国生物技术发展中心);链霉素(北京鼎国生物技术发展中心);二
4、甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);高效液相色谱分析仪(HPLC)(美国Agilent公司);荧光显微镜(Leica);DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂);微波炉(广东顺德);Model550酶标仪(BIO-RAD美国);凝胶成像系统(Tu-20，美国)。2方法2.1高效液相色谱法测定绿茶中EGCG含量2.1.1高效液相色谱条件色谱柱为C18，监测器：紫外监测波长(280nm);流动相为双重蒸水/乙腈/乙酸乙酯(86∶12∶2V/V/V)，流速：1.0ml/min。2.1.2标准曲线的绘制准确称
5、取EGCG0.0100g，用双蒸水溶解于10ml容量瓶中，经微孔滤膜过滤作为母液，通过梯度稀释得到终浓度为(0.0050，0.0025，0.0013，0.0006，0.0003)g/ml的EGCG待测溶液。2.1.3样品中EGCG含量的测定准确称取绿茶提取物0.0100g，用双蒸水溶于10ml容量瓶中，经微孔滤膜过滤作为待测样品。2.2细胞培养及MTT法检测细胞增殖情况BGC823细胞株购自山东省医学科学院，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养体系中，在37℃，50ml/LCO2的饱和湿度培养箱
6、中培养。取对数生长期的胃癌细胞BGC823以5×107/L浓度接种于96孔培养板,每孔100μl,37℃,50ml/LCO2培养箱中培养。24h后分别接入不同浓度的无菌EGCG溶液100μl,使最终浓度分别为5×10-3,1×10-2,2×10-2,4×10-2g/L,各组设8个重复孔,对照组加100μl培养液,在37℃,50ml/LCO2条件下继续培养48h。实验终止前加入新配制的5g/L的MTT溶液20μl,混匀,再继续培养4h.弃去上清液,每孔加DMSO200μl,充分振荡30min,溶解MTT沉
7、淀物,490nm测定每孔的吸光度A值。计算抑制率:抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。2.3DNA梯度检测细胞凋亡将1×108/L细胞接种于9个6cm培养皿中,24h后加入无菌EGCG溶液,使每3皿终浓度为2×10-2,3×10-2，4×10-2g/L,对照组加等量的培养液。继续培养48h,0.25%胰蛋白酶消化，1000r/min离心5min，细胞用1ml冰冷的PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清液，重复1次，细胞按以下步骤抽提DNA：①加消化缓冲液1ml，再加入蛋白
8、酶K(20mg/ml)15μl在55℃消化3h。②1∶1酚/氯仿抽提，离心7000r/min，15min。③再用氯仿抽提一次(注意操作动作要轻)。④取上清(不要搅动液面)，移入干净EP管中。⑤加入0.1体积的NaAc，(pH5.2，5mol/L),再加入2倍体积无水乙醇，小心混匀，-20℃过夜沉淀DNA，12000r/min离心5min。⑥用70%乙醇洗涤2次，12000r/min离心5min，倒净EP管中乙醇，待乙醇痕量挥发，加入50μl
