表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人胃癌bgc823细胞凋亡论文

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1、表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人胃癌BGC823细胞凋亡论文邹少娜，文小玲，刘晓萍，陈晓艳，王强，罗招阳【摘要】［目的］观察表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）诱导人胃癌BGC823细胞凋亡的生物学效应及分子机制。［方法］通过MTT法检测EGCG对BGC823细胞生长的影响；用形态学观察、流式细胞术和DNA琼脂糖凝胶电泳研究EGCG诱导BGC823细胞凋亡。I-1640培养液，在37℃，含5%CO2的饱合湿度的培养箱内培养传代。1.2药品与试剂EGCG：Sigma公司产品，纯度95%。小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品，MTT为Amresco公司产品；

2、细胞凋亡DNALadder检测试剂盒为北京博大泰克生物基因技术有限责任公司产品；Caspase-3、NF-κB(p65)、Bcl-2和Bax抗体为SantaCruz公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为武汉博士德生物有限公司产品。1.3MTT比色法测定取对数生长期细胞，接种于96孔平底培养板，每孔180μl(含0.9×104细胞)。培养6h后加入处理因素并设本底对照组、空白对照，使EGCG的终浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml每组设4个平行孔，继续培养48h。然后每

3、孔加入MTT20μl（5mg/ml），4h后即终止培养，弃上清液，每孔加入200μlDMSO，振荡摇匀，置酶联免疫检测仪在570nm波长处测量吸光度（A）值。按以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率（IR%）=（1-试验组A值/对照组A值）×100%。1.4细胞形态学观察按常规方法制备细胞爬片，用HE染色，光镜下观察细胞形态学改变。1.5琼脂糖凝胶电泳按DNALadder检测试剂盒说明抽提DNA，取样品5μl于2%琼脂糖凝胶电泳（8V/cm，2h），紫外凝胶成像系统下观察并照相。1.6流式细胞术分析0.25%胰蛋白酶消化，收集培养细胞，PBS洗2次，每次4

4、℃800r/min离心5min，去上清液后加入4℃PBS0.5ml，充分混匀悬浮细胞，计数制成约1×106细胞/ml×1ml的单细胞悬液。用4℃预冷的70%乙醇2ml固定细胞（4℃，48h~72h）充分混匀。固定细胞用PBS洗2次，加RNA酶50μl（浓度为0.5mg/ml），37℃水浴30min，加碘化丙啶（PI）50μl，浓度为1mg/ml，振荡混匀，避光置冰箱30min，300目尼龙网滤过，上机检测，计数10000个细胞，进行细胞周期和DNA含量分析。1.7Tris-ClpH7.5，150mMNaCl，10ml/LNP40，1mg/mlSDS，1

5、0g/L脱氧胆酸钠，1mMDTT，1mMPMSF，25μg/ml亮抑素，25μg/ml胰蛋白抑制剂）4℃裂解30min，超声碎裂30s，13000r/min，离心去细胞碎片，留含有全蛋白的上清液。用BCAassayreagent测定蛋白浓度，50μg蛋白与加样缓冲液混合，100℃变性5min，在10%不连续SDS-PAGE胶中电泳分离，电转移至PVDF膜，膜与一抗孵育12h，二抗孵育1h，用ECL发光法显色、曝光、显影、定影、水洗。胶片采用薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。1.8统计学处理采用SPSS10.0统计学软件，实验结果（x±s）表示，两组间比

6、较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-l作用BGC823细胞48h，其抑制率分别为29.04%±2.4%、48.44%±3.7%、62.51%±3.1%、72.97%±2.9%、79.29%±5.4%。EGCG作用BGC823细胞48h的IC50为39.9±2.6μg/ml（见图1）。2.2EGCG对BGC823细胞凋亡的影响2.2.1细胞凋亡形态学观察在光镜下，HE染色，未处理的BGC823细胞胞浆染成红色，胞核染成蓝色，细胞胞浆少，核浆比例大。经40μg/mlEGCG处理48h后，BGC823细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆

7、、皱缩，核染色质固缩积聚至核膜周边，核深染，见图2。2.2.2PI染色FCM分析流式细胞术检测结果显示：未处理的BGC823细胞48h凋亡率为1.8%±0.2%，用20、40、80μg/mlEGCG作用48h，凋亡率分别为9.8%±1.9%、15.7%±1.3%、32.1%±2.4%，凋亡率随浓度的增高而增高（P＜0.05）。2.2.3DNA琼脂糖凝胶电泳EGCG作用BGC823细胞后，可诱导BGC823细胞产生凋亡细胞的典型DNA梯形条带。以80μg/mlEGCG作用BGC823细胞24、48和72h来观察不同时间EGCG诱导DNA断裂。当EGCG作

8、用BGC823细胞24h时，未见DNA梯形条带，时间延长至48h、72h时，DNA梯形条带清晰