表没食子儿茶素没食子酸酯抑制人鼻咽癌细胞的生长机制

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1、表没食子儿茶素没食子酸酯抑制人鼻咽癌细胞的生长机制【摘要】目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)epigallocatechin3gallate,EGCG］抑制人鼻咽癌E2Z细胞系生长增殖的机制,寻找鼻咽癌治疗的新靶点.方法：用EGCG处理人鼻咽癌E2Z细胞,应用MTT试验观察不同浓度的EGCG对癌细胞生长增殖的影响；流式细胞仪检测用药前后细胞周期的变化；用逆转录聚合酶链反应分析ras相关区域家族1A（RASSF1A）mRNA表达情况.结果：从E2Z细胞生长曲线判定EGCG对细胞生长均有抑制作用；流式细胞分析结果显

2、示,G0/G1期细胞增加,S期细胞减少；经EGCG处理后,细胞中均有RASSF1AmRNA表达,且表达随药物浓度增高而增强.结论：EGCG对体外培养的鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用,可能是由于其能使因甲基化而失活的RASSF1A基因再转录,诱导该基因重新表达的结果.【关键词】没食子儿茶素没食子酸酯RASSF1A基因E2Z细胞系甲基化　0引言　　鼻咽癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤之一,尤其在我国的南部地区有很高的发病率.鼻咽癌的治疗方法主要是放射治疗,目前的化疗药物疗效均不十分显著.表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)epigalloc

3、atechin3gallate,EGCG］能使因甲基化而失活的抑癌基因重新表达，从而抑制肿瘤的生长［1］.我们用EGCG处理鼻咽癌E2Z细胞,观察了其对E2Z细胞生长增殖的影响及ras相关区域家族1A(RASSF1A)表达的变化,以寻找治疗鼻咽癌的有效药物.　　1材料和方法　　1.1材料人低分化鼻咽癌细胞系（E2Z）由广东医学院分子生物学与生物化学教研室惠赠.RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，碘化丙啶(PI)购于美国Sigma公司.EGCG购于美国Sigma公司.各PCR引物由上海生物工程公司合成.RTPC

4、R试剂盒为德国QIAGEN公司产品，流式细胞仪为EpicsX2型.　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及药物处理E2Z培养于含有100mL/L灭活的小牛血清、10万U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640完全培养基中，37℃，50mL/LCO2饱和湿度培养箱孵育，取对数生长期细胞实验.按每孔3000个细胞/孔接种于96孔培养板，细胞接种16h后分别用不同浓度EGCG（0，50，100，200mg/L）处理，每5孔为一药物浓度组，共接种4板，每日取1板，加入5g/LMTT液20μL,37℃孵育4h后弃去上清液,每

5、孔加入DMSO150μL,震荡10min,使结晶物充分溶解,在570nm波长酶联免疫检测仪上测定各孔A值,求其平均数,绘制增值曲线.　　1.2.2流式细胞术检测细胞周期同样方法接种处理E2Z细胞，48h后胰酶消化，收集细胞，700mL/L乙醇固定过夜，离心清洗后加入PI染液在流式细胞仪内检测各时相细胞比例.　　1.2.3半定量RTPCRTrizol法提取各组细胞的总RNA(操作步骤祥见说明书).以βactin为内参照.βactin引物序列：上游引物5′GTGCGTGACATTAAGGAG3′，下游引物5′CTAAG

6、TCATAGTCCGCCT3′，PCR产物大小517bp;RASSF1A引物序列:5′GCCCTCCAGCAAGAAG3′，5′TGAAGGCGTCCCAGTT3′,PCR产物大小362bp.反应条件如下：50℃反转录30min,95℃15min,94℃变性1min,54℃退火45s,72℃延伸1min,进行30个循环,72℃扩展10min.　　统计学处理：实验数据用x±s表示.采用SPSS16.0统计软件，方差齐时各组间两两比较采用LDS检验进行，方差不齐时各组间两两比较采用TamhanesT2检验进行，P<

7、0.05表示差异有显著性意义.所有实验至少重复3次.　　2结果　　2.1EGCG对细胞增值的影响经0，50，100，200mg/L的EGCG分别处理后,E2Z细胞生长增殖曲线示:各种浓度的EGCG处理组与对照组(无药组)相比,肿瘤细胞增殖均被抑制,且浓度越高,抑制越明显（图1）.　　图1不同浓度EGCG处理E2Z细胞的增殖曲线（略）　　2.2EGCG对E细胞周期的影响分别用不同浓度的EGCG（0，50，100，200mg/L）作用E2Z细胞48h，然后收集各组细胞以流式细胞仪检测DNA的含量.结果表明：EGCG可以使其细胞

8、周期G0/G1期比例增加（P<0.05），S期比例降低（P<0.05），说明EGCG作用E2Z细胞48h，可使其细胞周期阻滞于G0/G1期（表1）.　　表1EGCG作用48h后E2Z细胞周期分布（略）　　aP<0.05vs对照组.　　2.3