bfgf对兔骨髓基质细胞vegf因子表达及细胞生物行为的影响论文

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1、bFGF对兔骨髓基质细胞VEGF因子表达及细胞生物行为的影响论文常祺刘建胡蕴玉孟国林白建萍彭磊【关键词】血管内皮细胞生长因子EffectofbFGFonVEGFexpressionandbiologicalbehaviorofmarroalcells【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofbasicfibroblastgroarroalcells.METHODS:Themarroalcellsofthefemurofrabbitsplesultiplication,alkalinephos

2、phataseactivitiesdetection,theputeranalysisofboneclustersandthedetectionofratioofVEGFpositivecells.RESULTS:TheresandtheresultsoftreatmentgroupsulateboththemultiplicationandosteogenicpotentialofmarroalcellsinadosedependentmannerandthebestdoseofbFGFis1200kUL-1.【Keyarr

3、oalcell【摘要】目的：观察兔骨髓基质细胞经bFGF刺激后，其VEGF因子表达及细胞生物行为的变化.方法：取兔双侧股骨骨髓基质细胞，采用骨髓基质细胞体外培养技术，分别以不同剂量bFGF刺激细胞，并设立空白对照组.培养5d后，进行细胞形态（HE染色）、增殖情况（细胞记数法与MTT法）、碱性磷酸酶（改良钙钴法染色）、成骨结节（图像分析）、VEGF阳性细胞率（免疫组化染色）等项目的检测.结果：不同剂量组间各项观测指标差异均显著，结果均优于空白对照组.bFGF促进细胞增殖与VEGF表达最佳剂量为1200kUL1.结论：bFGF能促

4、进骨髓基质细胞增殖，促进VEGF的表达.freela公司，bFGF试剂购自双鹭公司，VEGFmAb及SP试剂盒购自迈新公司.骨髓基质细胞原代培养：取幼兔杀死，在无菌条件下取出双侧股骨和肱骨，去除骨外膜，DMEM液冲洗3次，用注射器反复冲洗骨髓腔，冲出的骨髓细胞接种于装有适量培养液（DMEM培养基，含100mLL-1胎牛血清）的培养瓶中，置于50mLL-1CO2培养箱中37℃恒温培养，24h后吸出悬浮细胞，用DMEM液冲洗后，留下贴壁细胞继续培养.而后隔日换液，观察细胞生长情况.细胞融合成片，长满培养瓶底部后，用2.5gL-1胰

5、蛋白酶消化，传代培养.1.2方法将bFGF试剂溶解于DMEM中，针头滤器过滤除菌.第4代细胞传代后，分别用含bFGF0，200，400，600，800，1000，1200和1600kUL-1的血清培养液培养，同时分组.取第4代骨髓基质细胞，以消化法传代后，按以上分组方法加入不同剂量bFGF达到预期浓度，调整细胞密度至1×107L-1，接种于50mL培养瓶.置于37℃、饱和湿度、50mLL-1CO2培养箱内培养.隔日换液.每4～6h在倒置显微镜下观察细胞形态.另取第4代细胞，传代后调整细胞密度至1×107L-1，接种于50mL培

6、养瓶（瓶中预先置入盖玻片），培养4d后，取出盖玻片，PBS冲洗3次，750mLL-1乙醇固定，行HE染色(Fig1).取第4代骨髓基质细胞，以消化法传代后，按以上分组方法加入不同剂量bFGF，调整细胞密度至1×107L-1，接种于24孔培养板内，放置于培养箱内，隔日换液.细胞培养5d后以胰蛋白酶消化，用细胞记数板记数细胞，每孔重复3次，取均值.细胞培养5d后，每孔加入MTT溶液（5gL-1）20μL，温箱内培养4h后，吸弃孔内上清，每孔内加入150μL纯DMSO，震荡10min，使结晶充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检

7、测仪上测定各孔吸光度A值.图1兔骨髓基质细胞染色(略)1.2.1碱性磷酸酶（ALP）第4代培养细胞长满后，胰酶消化制成密度为1×107L-1的细胞悬液，接种于事先放入盖玻片的24孔板内，按1.2分组方法加入不同剂量bFGF.培养5d后取出盖玻片，4℃生理盐水冲洗，置于冷丙酮中固定15min，而后用改良钙钴法染色(Fig2).去除上清，用10mmolL-1PBS冲洗3次，吸干，每孔加1mLL-1TritonX10050μL置4℃冰箱过夜，镜下观察已无明显细胞结构，经反复吹打后加入ALP检测试剂盒内新配置的底物100μL/孔，温箱

8、内30min，每孔加0.2molL-1NaOH50μL终止反应.在酶联免疫检测仪上选择410nm波长检测各孔吸光度A值.图2兔骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色，以胞质内有黑色颗粒堆积者为阳性(略)1.2.2体外成骨能力测定取第4代骨髓基质细胞，传代后按1×107L-1细胞密度接种于