细胞生物学的研究方法

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1、细胞生物学研究方法生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜技术（lightmicroscopy）普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）原理与应用直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）原理应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构样品的三维结

2、构。相差显微镜（phase-contrastmicroscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动电子显微镜技术(Electromicroscopy)电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM2

3、00nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图负染色技术（Negativestaining）与金属投影染色背景，衬托出样品的精细结构冰冻蚀刻技术（Freezeetching）（技术示意图）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。快速冷冻

4、深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）SPM(Scanningprobemicroscope)原理与应用：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子

5、成象。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题扫描探针显微镜（ScanningProbeMicroscope）SPM(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.1～0.2nm

6、，纵分辨率可达0.01nm）；（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。（4）可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。扫描遂道显微镜(scanningtunnelingmicroscope)光镜样本制作分辨率是指区分开两个质点间的最小距离第二节细胞组分的分析方法离心分离技术细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术定量细胞化学分析技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞的培养细胞工程一、光

7、学显微镜技术（lightmicroscopy)二、电子显微镜技术三、扫描遂道显微镜普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）激光共焦扫描显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术扫描电镜一、离心分离技术用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂