细胞生物学的研究方法1

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1、第三章细胞生物学研究方法西南大学生命科学学院冯全义主要内容第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养细胞工程与显微操作技术第一节细胞形态结构的观察方法一光学显微镜技术1、根据光源不同，可分为:1）、光学显微镜：以可见光（或紫外光）为光源2）、电子显微镜：以电子束为光源光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构2、分辨率(resolution)R=0.61λ/nSinαn=介质的折射率；空气为1.油为1.5α=样品对物镜角孔径的半角；sinα的最大值为1λ=照明光源的波长0.61是一个恒定的参数；表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度分辨率概念：是指能区分两个物点间最小距离的

2、能力分辨距离越小，分辨率越高，即分辨细微结构的能力越大提高分辨能力的方法：改变n：n越大；R越小；分辨能力好改变λ：λ越小；R越小；分辨能力好2、放大率最终成像的大小与原物体大小的比值总放大率=物镜放大率×目镜放大率例如：目镜10X；物镜40X；则总放大率400X注意分辨率与放大率的区分电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本领光源透镜真空光学显微镜300nm可见光玻璃透镜不需真空200nm(油镜)可见光玻璃透镜不需真空100nm紫外光玻璃透镜不需真空电子显微镜0.1nm电子束电磁透镜真空3、普通光学显微镜构成①照明系统：光源、聚光器②光学放大系统：物镜、目镜组成；为了消除球差和色差③机械装

3、置：用于固定材料和观察方便双筒显微镜：亮度较单筒暗；双眼观察立体感较单筒强双筒显微镜单筒显微镜（二）、荧光显微镜(fluorescencemicroscope)1、工作原理：利用紫外线光源(如弧光灯、水银灯等发出)通过照明设备把切片或活染细胞透视出来1）自发荧光细胞中有些物质（如叶绿素等）紫外线照射后可发荧光2）诱发荧光一些物质紫外线照射后不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）2、荧光显微镜和普通显微镜的区别1）照明方式：通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上2）光源：为紫外光，波长较短，分辨力高3）特殊的滤光镜

4、系统片激发滤色镜（exciterfilter）：光源前的用以滤除不需要的光线UV（紫外）；V（紫）；B（蓝）；G（绿）阻断滤色镜（barrierfilter）：目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，保护眼睛落射式照明原理荧光显微镜的光通路尼康E800荧光显微镜其它类型的显微镜（三）、激光共聚焦扫描显微境(laserconfocalscanningmicroscope)用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面扫描成像分辨力较高，是普通光镜的3倍激光共聚焦扫描显微镜LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管（四）、暗视野显微镜暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)用特殊的聚光器使照明光线不能进入

5、物镜被放大在黑暗的背景下呈现明亮的像反差增大，分辨率提高观察未经染色的活体或胶体粒子（五）、相差显微镜相差显微镜（phasecontrastmicroscope）荷兰人Zernike1932年发明，获1953年诺贝尔物理奖作用：可观察未经染色的标本和活细胞基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，而提高结构间的对比度入射光环共轭区补偿区(并协区)（六）、偏光显微镜（polarizingmicroscope）检测有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体等光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光（七）、微分干涉差显微镜（differentialinterferencecontras

6、tmicroscope）1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarkicontrastmicroscope）利用的偏振光;标本可略厚，折射率差别更大基因注入、核移植、转基因等的显微操作（八）、倒置显微镜倒置显微镜特点:物镜与照明系统颠倒观察培养的活细胞具有相差物镜莱卡倒置显微镜一般光学显微镜的样品制备与观察1、样品的固定(fixation)●目的:1)杀死细胞，稳定细胞的化学成份2)使样品在后面的处理和切片时不受到破坏●做法:最简单是直接浸泡在固定液中一般用有缓冲作用的醛类固定液，(甲醛或戊二醛)●醛类固定液作用机理：能够

7、与蛋白质的游离氨基形成共价键，而将邻近的蛋白质分子交联一起2、包埋和切片(embeddingandsectioning)●包埋:常用包埋剂:液态的石蜡或树脂使之渗入整块组织，后将之硬化成固体的包埋块●切片：切片机切割包埋块，制备成薄切片适用于光学显微镜观察的切片厚度为l～10μm切片机进行样品切片3、染色(staining)：●目的:给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征●一些典型的有机染料●苏木精(hematoxylin