肿瘤细胞多药耐药基因及产物p糖蛋白检测方法的研究进展论文

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1、肿瘤细胞多药耐药基因及产物p糖蛋白检测方法的研究进展论文摘要:肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药（MDR）是目前肿瘤病人化疗失败的主要原因。肿瘤细胞的多药耐药有多种类型。本文对Mdr1基因及P糖蛋白（pgp）的生物学特性及检测方法作一综述。目前，化疗仍然是治疗恶性肿瘤的重要手段，尽管化疗方案的改进及新药的使用，临床化疗效果越来越好，但仍然发现一些患者在化疗前后对某些药物产生耐药性，从而影响化疗效果。研究发现，导致肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤对化疗药物的多药耐药。多药耐药是指由一种药物诱发，对该药耐药的同时

2、.freelRNA测定法，包括Northenblot、Slotblot、RNA原位杂交法及RT-PCR检测法。2.1免疫组化法常用的方法是免疫组化ABC法。冰冻切片常规处理后，与抗pgp的单克隆抗体孵育，然后加入生物素标记的二抗孵育，再加亲合素-过氧化酶复合物孵育、洗片，最后用含0.03%-0.05%过氧化氢的DAB液显色分析结果。免疫组化法是较传统的检测方法，由于其操作简便，不需要贵重仪器，且可分析肿瘤细胞的异质性，因此是目前国内外常用的检测方法。由于其特异性和敏感性较低，且需要冰冻组织切片，因此

3、1994年karoly等对此方法进行了改进，创建了一种新的“免疫组织化学夹心染色法（LPS）”，此方法直接用福尔马林固定的组织细胞，经石腊包理、切片、过氧化氢处理后，与抗pgp的单克隆抗体JSB-1孵育后有序地加三层过氧化物酶标记的第二抗体第一层为过氧化物酶标记的兔抗鼠IgGf(ab’)2，第二层为鼠单克隆过氧化酶抗过氧化酶复合物，第三层为过氧化物酶标记的兔抗鼠IgGf(ab’)2的孵育、洗片、染色、分析结果。LPS法直接取组织细胞固定，不需使用冰冻切片，且因增加了三层过氧化物酶标记的第二抗体，使免

4、疫染色密度增加，结果更清晰。由于JSB-1抗体对Mdr1pgp具有特异性，与Mdr2pgp无交叉反应，因此提高了LPS法的特异性。以往免疫组化结果不能进行定量分析，此方法在应用上受到一定的限制，近年来由于数学显微图像分析方法的应用，免疫组化结果可进行定量分析，使得免疫组化法更具实用性7，8。2.2免疫印迹分析法粗膜蛋白经电泳分离后转移到硝酸纤维薄膜上，用抗pgp单克隆抗体作为一抗，同位素标记的兔抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹反应，分光光度计进行定量分析。此方法利用抗原抗体的特异反应，排除了其它蛋白质的

5、干扰，但敏感性较低11。2.3流式细胞仪（FCM）分析法取单个核细胞分装小管，加入荧光标记的抗pgp单克隆抗体进行孵育，用荧光标记的小鼠IgG作阴性对照，PBS冲洗除去未给合的荧光抗体后，FCM定量分析，以20%以上细胞染上荧光者判定为pgp阳性。FCM检测pgp，取材方便，可直接取肿瘤组织细胞，骨髓，还可取外周静脉血，操作简便、快速（每秒可测5000-10000个所要细胞）、准确，能对pgp进行定量分析，适宜批量标本检测，但由于仪器价格昂贵，目前只有少数实验室可进行FCM分析法10。2.4Nort

6、hernBlot和SlotBlot检测法用异硫氰酸胍溶液抽提细胞质中RNA，氯化铯溶液进行梯度离心，抽提的RNA经过变性、分光光度计下测定其浓度，电泳后转移到硝酸纤维薄膜上（Slotblot分析法则直接将RNA点在硝酸纤维薄膜上），用50%甲醛、5×Denhardt’s、5×SSC溶液和DNA模板与放射性标记的MdrlcDNA探针进行预杂交和杂交、放射自显影后分光光度计进行定量分析。通过这两种方法检测Mdr1mRNA较敏感，但不足之处是需要的标本量较大，且需用放射性标记的探针，会引起同位素污染。2.

7、5RNA原位杂交法石腊包埋切片按常规处理后与放射性标记的MdrlcDNA探针进行杂交，放射自显影后进行结果分析。此方法采用完整细胞作为测定对象，能分析Mdr1过度表达的个别细胞或细胞亚群，但系手工操作，较难掌握10。2.6RT-PCR检测法提取样本总RNA，合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应总体积一般为25μL，含0.1μg的模板DNA，20μmol/L,4dNTPS,TaqdNA聚合酶10×buffer5uL,Mdr1基因上下游引物及内对照β1微球蛋白（β2M）上下游引物各2

8、0pmol。PCR扩增产物经琼脂糖电泳后，紫外灯下照像，激光密度扫描仪定量分析。以β2M为定量内参标，以Mdr1/β2M的比值大小来代表Mdr1水平的高低。RT-PCR产物的绝对定量很困难，因RNA的提取、纯度测定、cDNA逆转率和PCR扩增效率各个环节均影响Mdr1mRNA定量分析的精确度，因此在检测过程中需要设内对照，一般选择与Mdr1基因扩增动力学相似的β2M作为内参标，以Mdr1/β2M比值大小来衡量Mdr1水平的高低，从而消除上述因素引起的定量误差。由于Md