姜黄素逆转p糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究

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1、姜黄素逆转P糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究作者：王磊柯红王一羽任东明【摘要】目的研究姜黄素对P糖蛋白（P-gp）介导的膀胱肿瘤多药耐药的逆转作用。方法采用MTT法测定药物的体外杀伤作用，应用流式细胞术测定细胞内罗丹明浓度。结果姜黄素不增加阿霉素对BIU-87的细胞毒性作用(P＞0.05)；而对于BIU-87/ADR，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性(P＜0.05)，逆转指数为4.0。姜黄素明显抑制P-gp的药物外排作用可能是关键因素。结论姜黄素通过抑制P-gp的药物外排作用有效逆转多药耐药。【关键词】姜黄素P糖蛋白阿霉素多药耐药逆转化疗是膀胱癌术后治疗的重要方法。膀

2、胱肿瘤具有易复发和产生多药耐药(multidrugresistence,MDR)的生物学特性，加强膀胱癌MDR逆转研究具有重要意义。就目前研究而言，MDR的逆转包括以下策略：使用化疗增敏剂、药物化学修饰、反义技术、载体技术等，对植物药研究较少。本实验拟观察姜黄素能否逆转多药耐受糖蛋白(P-glycoprotEin,P-gp)介导的膀胱癌MDR、逆转效果及其可能机制。　　1材料与方法　　1.1材料姜黄素（Curcumin,CUR），罗丹明－123（Rhodamine-123，R-123）及MTT均为Sigma公司产品。盐酸阿霉素（Adriamycin，ADR）为深圳万乐药

3、业公司产品。DMEM培养基为Gibco公司产品。膀胱移行细胞癌株BIU-87，由北京医科大学泌尿外科研究所馈赠；耐药株BIU-87/ADR系由本实验室通过采用递增阿霉素剂量的方式诱导建立的呈典型MDR表型的耐药细胞亚株。高表达P-gp。细胞在含0.5mg·L-1浓度的阿霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基中以37℃，5%CO2条件培养，实验前2d换无药培养基培养。　　1.2方法　　1.2.1MTT实验将处于对数生长期的两种细胞分别以2×104/ml浓度接种于96孔培养板，每孔终体积200μl。上述条件下培养24h，小心吸尽每孔培养液。实验组Ⅰ分别加入不同浓度的阿霉素、实

4、验组Ⅱ分别加入不同浓度的阿霉素加姜黄素（以终浓度0.1%DMSO助溶）。阿霉素终浓度分别为0.05，0.1，0.25，1.5，5(μg/ml)，姜黄素终浓度为25μmol·L-1。对照组Ⅰ为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组Ⅱ为不加药物仅加细胞的阴性对照，以上述条件培养48h后，每孔加MTT(5mg/ml)液20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加150μlDMSO，振荡10min使结晶物充分溶解。由空白孔调零后，以酶标仪检测490nm处的光吸收值(A)。　　细胞存活率(IC)=实验组平均A值/阴性对照组平均A值　　逆转指数(RI)=IC50(B

5、IU-87/ADR+ADR)/IC50(BIU-87/ADR+ADR+CUR)　　1.2.2罗丹明外排实验罗丹明作为P糖蛋白（P-glycoprotEIn,P-gp）的转运底物能较好的代表其转运功能［1,2］。将处于指数生长期的BIU-87/ADR细胞以2×104/ml接种于24孔培养板，每孔终体积1ml。上述条件下培养24h。小心吸弃培养液，加入罗丹明至终浓度为5μg·ml-1，上述条件继续培养30min，吸弃培养液，加入不含罗丹明的培养液。实验组Ⅰ仅含培养液和细胞，实验组Ⅱ在Ⅰ的基础上加入姜黄素至终浓度为25μmol·l-1，对照组为含细胞不加药液组。分别于0，0.

6、5，1.0，2.0h收获细胞。细胞收获方法为：吸弃培养液、0.25%胰酶消化、冷PBS(0℃)吹洗、离心(800r/min)3次后，500μl冷PBS吹散细胞，在流式细胞仪上检测(激发波长480nm，发射波长540～660nm)，以荧光强度平均值（Mean）表示细胞内罗丹明浓度。细胞内罗丹明浓度以下式计算：A=实验组平均荧光强度值-对照组平均荧光强度值。　　1.2.3统计学处理实验结果取3次实验的均值，标准差均小于5%，组间显著性差异用t检验。　　2结果　　2.1MTT试验预试验以姜黄素最高浓度25μmol·L-1作用两细胞株48h，细胞存活率均在95%以上，排除了对细

7、胞的毒性作用（见表1）。结果表明，姜黄素略增加阿霉素对BIU-87的细胞毒性作用(P＞0.05)；而对于BIU-87/ADR，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性(P＜0.05)，逆转指数为4.0。　　表1细胞毒分析IC50（略）　　*P＞0.05，**P＜0.01　　2.2细胞内罗丹明浓度图1为不同时间段细胞内罗丹明浓度的流式细胞仪检测结果。可以看出，在每一时间点，姜黄素组R-123浓度均显著高于无姜黄素组。姜黄素明显抑制了细胞内R-123的外排(P<0.05)。　　图1R-123外排实验（略）　　3讨论　　尽管生物技术飞速发展，传统医学