肿瘤细胞多药耐药基因及产物p糖蛋白检测方法的研究进展

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1、肿瘤细胞多药耐药基因及产物p糖蛋白检测方法的研究进展摘要:肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药是目前肿瘤病人化疗失败的主要原因。肿瘤细胞的多药耐药有多种类型。本文对Mdr1基因及P糖蛋白的生物学特性及检测方法作一综述。　　目前，化疗仍然是治疗恶性肿瘤的重要手段，尽管化疗方案的改进及新药的使用，临床化疗效果越来越好，但仍然发现一些患者在化疗前后对某些药物产生耐药性，从而影响化疗效果。研究发现，导致肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤对化疗药物的多药耐药。多药耐药是指由一种药物诱发，对该药耐药的同时，对其结构和作用机制无关的化疗药物产生交叉耐药。多药耐药的类型有多种。如Mdr1及其产物pgp的表达

2、增高，多药耐药相关蛋白基因的扩增或表达增加，DNA拓朴异构酶Ⅱ活性增高或性质发生改变，谷胱甘肽解毒系统酶活性增高等。本文就Mdr1和pgp的生物学特性及检测方法作一综述。　　1多药耐药基因1和P糖蛋白的生物学特性　　Mdr1MDR基因在人类有二种Mdr1和Mdr2，其中Mdr1与肿瘤的多药耐药有关。Mdr2的功能尚不清楚，但Mdr1和Mdr2基因序列具有较高的同源性。人类Mdr1基因位于第7号染色体长臂上，含有28个外显子，内含子与外显子交界符合经典的A/G规则，全长为，含有一个开放读框，编码1280个氨基酸多肽，经糖基化后形成170KD的pgp[1]。目前对Mdr1基因的表达

3、调控还处于研究之中。研究表明抗肿瘤药物、致癌剂、紫外线、热应激等都可使Mdr1基因活化，ras、raf、p53等癌基因也参与Mdr1基因的表达调控[2，3]。有人发现，在原发性乳腺癌患者中，Mdr1基因的转录受Y盒转录因子的调节，而且YB-1的位置与Mdr1基因表达密切相关，在对药物敏感的乳腺癌细胞株MCF-7中，YB-1位于胞浆中，而在耐药细胞株MCF-7中，YB-1位于细胞核中，因此认为YB-1也参与Mdr1基因的调控[4]。　　pgp是由Mdr1基因编码、其分子量为170KD、由1280个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，由两个同源部分组成，两部分之间的同源性大约为48%，每一部分

4、约含有6个疏水跨膜区和一个ATP结合位点，通过ATP供给能量，将亲脂性药物泵出细胞外。在正常人体的肾上腺、肾、肝、结肠、胰及脑毛细血管内皮细胞中均有Mdr1pgp的表达，其生理功能为将细胞内的毒性代谢产物泵出细胞，对组织细胞起保护作用。在脑组织中，Mdr1pgp对维持血脑屏障起重要作用，它可将内皮细胞中的异物排列毛细血管腔而保护脑组织。在正常人体的造血干细胞，T、B淋巴细胞，NK细胞上都有pgp表达，其生理功能仍不清楚，但研究表明pgp参与人体外周血T淋巴细胞中的细胞因子的输送[5，6]。Mdr1被克隆并发现在某些正常组织中表达后，人们就开始对肿瘤组织中的Mdr1进行分析。在肿

5、瘤细胞中，pgp通过ATP供能，将长春新碱、秋水仙素、放线菌素D等药物泵出细胞外，导致肿瘤细胞耐药。　　Mdr1和pgp的检测方法　　Mdr1和pgp的检测方法主要有两类，一类是蛋白质定法，包括免疫组化法、免疫印迹法和流式细胞仪检测法等。一类是mRNA测定法，包括Northenblot、Slotblot、RNA原位杂交法及RT-PCR检测法。　　免疫组化法常用的方法是免疫组化ABC法。冰冻切片常规处理后，与抗pgp的单克隆抗体孵育，然后加入生物素标记的二抗孵育，再加亲合素-过氧化酶复合物孵育、洗片，最后用含%-%过氧化氢的DAB液显色分析结果。免疫组化法是较传统的检测方法，由于

6、其操作简便，不需要贵重仪器，且可分析肿瘤细胞的异质性，因此是目前国内外常用的检测方法。由于其特异性和敏感性较低，且需要冰冻组织切片，因此1994年karoly等对此方法进行了改进，创建了一种新的“免疫组织化学夹心染色法”，此方法直接用福尔马林固定的组织细胞，经石腊包理、切片、过氧化氢处理后，与抗pgp的单克隆抗体JSB-1孵育后有序地加三层过氧化物酶标记的第二抗体[第一层为过氧化物酶标记的兔抗鼠IgGf(ab’)2，第二层为鼠单克隆过氧化酶抗过氧化酶复合物，第三层为过氧化物酶标记的兔抗鼠IgGf(ab’)2]的孵育、洗片、染色、分析结果。　　LPS法直接取组织细胞固定，不需使用

7、冰冻切片，且因增加了三层过氧化物酶标记的第二抗体，使免疫染色密度增加，结果更清晰。由于JSB-1抗体对Mdr1pgp具有特异性，与Mdrpgp无交叉反应，因此提高了LPS法的特异性。以往免疫组化结果不能进行定量分析，此方法在应用上受到一定的限制，近年来由于数学显微图像分析方法的应用，免疫组化结果可进行定量分析，使得免疫组化法更具实用性[7，8]。　　2.免疫印迹分析法粗膜蛋白经电泳分离后转移到硝酸纤维薄膜上，用抗pgp单克隆抗体作为一抗，同位素标记的兔抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹反应，分光光