重组质粒载体pcmv-lrig2转染biu-87细胞株的效应研究

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1、重组质粒载体pCMV?LRIG2转染BIU?87细胞株的效应研究李国灏，杨为民，叶章群，文博，刘征，郭东生【关键词】LRIG2；膀胱肿瘤；效应；V?LRIG2及兔抗人LRIG2蛋白多克隆抗体由瑞典Umea大学HakanHedman教授惠赠，该质粒携带有LRIG2全长mRNA及其终止序列，因而能够在真核细胞内表达LRIG2蛋白但不能表达GFP蛋白，故转染后的细胞不能产生绿色荧光；羊抗兔IgG二抗购自晶美公司；1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自四季青公司；限制性内切酶EcoRⅠ购自TaKaRa公司；质粒小量及大量提取试剂盒购自Omega公司；脂质体Lipofectam

2、ine2000购自LifeTechnologies公司；蛋白提取试剂盒购自Pierce公司；Transa公司。1.2细胞培养BIU?87细胞株用含有10%(体积分数)胎牛血清(杭州四季青公司)的1640完全培养基在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。1.3质粒的小量提取与酶切鉴定将重组质粒载体pCMV?LRIG2转化入感受态大肠杆菌DH5α菌株内，常规铺板，挑取菌落，扩增，采用质粒小提试剂盒提取质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳。1.4pCMV?LRIG2转染BIU?87细胞将BIU?87细胞以1×106接种到6孔板中

3、，待其生长到90%融合时，应用脂质体Lipofectamine2000按试剂盒说明书进行转染，分为空白组BIU?87(未转染)、对照组BIU87?GFP(转染pEGFP?N1)和实验组BIU87?LRIG2(转染pCMV?LRIG2)3组。1.5转染细胞的筛选转染48h后用含有800μg/mLG418、10%(体积分数)胎牛血清的RPMI1640进行筛选，隔天更换一次培养液，待对照组细胞全部死亡(1周)后，换G418浓度为400μg/mL的培养液维持培养。2-3周后，生长出抗性克隆。经扩大培养、连续传代1-2个月，继而进行其他各项指标的检测。1.6蛋白的提取及I1640培养液

4、150μL，每组设24个复孔，未接种细胞的孔作空白对照。置于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。每天各组取3孔用MTT比色法进行检测，参照波长630nm，检测波长570nm，根据测定的A值绘制细胞生长曲线。1.8细胞侵袭力测定采用TransL；用1mg/mL基质胶铺于8μm孔径的TransL(含200μL趋化剂)10%(体积分数)胎牛血清培养基，将肿瘤细胞悬液以每室1.5mL加入上室，培养24h后，去除滤膜上层细胞行HE染色。镜下(×200)计数滤膜下表面细胞数，随机计数10个视野，计算平均值，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。1.9细胞同质黏附能

5、力测定采用细胞同质黏附实验。用2.5g/L的胰酶将3组细胞分别制成无血清1640培养基培养的单细胞悬液，按1×105/mL浓度接种于96孔板(100μL/孔)，每组设10个复孔，于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中孵育。分别于60、90min后检测5个复孔，用37℃预热的D?Hanks液小心冲洗2次，收集未黏附的肿瘤细胞计数，从而计算出黏附细胞的数目。1.10统计学分析应用SPSS12.0统计软件，采用两样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。〖2〗现代泌尿外科杂志〖3〗第13卷1期〖2〗李国灏，杨为民，叶章群，等.重组质粒载体pCMV?LRIG2转染B

6、IU?87细胞株的效应研究2结果2.1质粒与酶切鉴定根据文献所示，重组质粒pCMV?LRIG2全长约8.7kb，LRIG2的mRNA全长约4kb，空质粒pEGFP?N1全长4.7kb，将所提取质粒及其酶切产物电泳后可见三条片断长度分别为8.7kb、4.7kb及4.0kb(图1)，与预计相符。2.2细胞转染及稳定筛选转染24h后可在倒置荧光显微镜(Nikon)下观察到对照组的细胞发绿色荧光，而实验组和空白组的细胞则不发绿色荧光。转染48h后，用含有800μg/mLG418、10%(体积分数)胎牛血清的1640培养基进行筛选，2周后，空白组细胞全部死亡，此时，将G418的浓度降为

7、400μg/mL，3周后生长出抗性克隆。2.3V?LRIG2质粒的细胞侵袭力显著下降，而转染空pEGFP质粒的细胞侵袭力无明显改变，即影响细胞侵袭的因素为质粒所携带的LRIG2基因。(责任编辑：)2.6细胞同质黏附能力黏附60min及90min后计数黏附的细胞，结果显示实验组黏附的细胞数均显著高于对照组及空白组，其差异均具有显著性(P<0.01)；而对照组及空白组在两个时段的黏附细胞数目差异则无显著性(P>0.05,表2)。提示转染了pCMV?LRIG2质粒的细胞其黏附能力明显升高。表1三组