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时间:2018-09-30
《重组质粒载体pCMVLRIG2转染BIU87细胞株的效应研究.doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、重组质粒载体pCMVLRIG2转染BIU87细胞株的效应研究作者:李国灏,杨为民,叶章群,文博,刘征,郭东生【关键词】LRIG2;膀胱肿瘤;效应;Westernblot;RTPCRLRIG2基因是新近发现的一组基因——LRIGs基因的一种,他们编码的产物是一类结构相似的跨膜糖蛋白,在其胞外段有多个亮氨酸重复序列和Ig样结构域(tandemleucinerichrepeatsandimmunoglobulinlikedomains,LRIG)[12]。研究发现,在多种肿瘤组织内有LRIG2基因表达水平的下调[23]。基于上述研究结果,我们拟通
2、过基因转染技术,将外源性LRIG2基因导入膀胱肿瘤细胞株并进行筛选,观察转染后LRIG2基因对膀胱肿瘤生长能力、侵袭力及黏附力等生物学行为的影响。1材料与方法1.1试剂来源膀胱肿瘤细胞株BIU87由我科实验室冻存;携带有LRIG2全长mRNA的重组质粒载体pCMVLRIG2及兔抗人LRIG2蛋白多克隆抗体由瑞典Umea大学HakanHedman教授惠赠,该质粒携带有LRIG2全长mRNA及其终止序列,因而能够在真核细胞内表达LRIG2蛋白但不能表达GFP蛋白,故转染后的细胞不能产生绿色荧光;羊抗兔IgG二抗购自晶美公司;1640培养基购自Gibco公司
3、;胎牛血清购自四季青公司;限制性内切酶EcoRⅠ购自TaKaRa公司;质粒小量及大量提取试剂盒购自Omega公司;脂质体Lipofectamine2000购自LifeTechnologies公司;蛋白提取试剂盒购自Pierce公司;Transwell培养板购自Corning公司;基质胶购自Sigma公司。1.2细胞培养BIU87细胞株用含有10%(体积分数)胎牛血清(杭州四季青公司)的1640完全培养基在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。1.3质粒的小量提取与酶切鉴定将重组质粒载体pCMVLRIG2转化入感受态大肠杆菌DH5α菌株内,
4、常规铺板,挑取菌落,扩增,采用质粒小提试剂盒提取质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后,10g/L琼脂糖凝胶电泳。1.4pCMVLRIG2转染BIU87细胞将BIU87细胞以1×106接种到6孔板中,待其生长到90%融合时,应用脂质体Lipofectamine2000按试剂盒说明书进行转染,分为空白组BIU87(未转染)、对照组BIU87GFP(转染pEGFPN1)和实验组BIU87LRIG2(转染pCMVLRIG2)3组。1.5转染细胞的筛选转染48h后用含有800μg/mL5G418、10%(体积分数)胎牛血清的RPMI16
5、40进行筛选,隔天更换一次培养液,待对照组细胞全部死亡(1周)后,换G418浓度为400μg/mL的培养液维持培养。2-3周后,生长出抗性克隆。经扩大培养、连续传代1-2个月,继而进行其他各项指标的检测。1.6蛋白的提取及WesternBlot分析收集3组细胞,应用动物蛋白提取试剂盒分别提取3组细胞的总蛋白,12000g离心15min,将上清转管于-80℃冻存。采用Bradford法测量蛋白浓度后,在8%(80g/L)SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳,上样量为30μg总蛋白。电泳后,使用电转移仪将样品转至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉室温封闭2h,分别加入LRI
6、G2兔抗人多克隆抗体(1∶50)、EGFR兔抗人多克隆抗体(1∶2000)室温作用1h。洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶1000),室温作用1h。洗膜,压片,放射自显影。1.7细胞生长曲线的测定用2.5g/L的胰酶将3组细胞分别消化成单细胞悬液,调整细胞数为1×103/mL,接种于96孔板,并加含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI1640培养液150μL,每组设24个复孔,未接种细胞的孔作空白对照。置于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。每天各组取3孔用MTT比色法进行检测,参照波长630nm,检测波长570nm,根据测定的
7、A值绘制细胞生长曲线。1.8细胞侵袭力测定采用Transwell法进行检测。用2.5g/L的胰酶将3组细胞分别消化成单细胞悬液,调整细胞数为1×106/mL;用1mg/mL基质胶铺于8μm孔径的Transwell微孔滤膜上,下室加入2.6mL(含200μL趋化剂)10%(体积分数)胎牛血清培养基,将肿瘤细胞悬液以每室1.5mL加入上室,培养24h后,去除滤膜上层细胞行HE染色。镜下(×200)计数滤膜下表面细胞数,随机计数10个视野,计算平均值,以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。1.9细胞同质黏附能力测定采用细胞同质黏附实验。用2.5g/L的胰
8、酶将3组细胞分别制成无血清1640培养基培养的单细胞悬液,按1×1
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