质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性

《质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性作者：郭敏，郎明健，曾秋棠，杨汉东，闵新文【摘要】目的：探讨应用阳离子脂质体lipofectamine2000在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性.方法：构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达质粒.将22只雄性SD大鼠随机分为4组：阴性对照组（Ⅰ组，n=4），心肌注射组（Ⅱ组,n=6），尾静脉注射组(Ⅲ组，n=6)和冠状动脉灌注组（Ⅳ组，n=6）.分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染.Ⅱ～Ⅳ组于转染后2，14d时间点各随机处死3只大鼠，阴性对照组各处死2只大鼠,取心肌组织作快速冰冻切片，荧光显

2、微镜下观察EGFP表达情况.结果：在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，阴性对照组隐约可见淡绿色荧光，第2天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织.各转染组荧光强度与阴性对照组相比,其差异均有统计学意义(P<0.05).心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义（P=0.17）.冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强7.37倍（P=0.013）.第2周转染各组荧光强度明显减弱，与阴性对照组差异无统计学意义(P=0.41).结论：阳离子脂质体lipofectamine2000可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织，而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率.

3、【关键词】脂质体；心肌；转染；质粒；绿色荧光蛋白质类0引言　　基因治疗为心血管疾病的治疗带来了新的希望［1］，如何高效、稳定、安全地将目的基因转染到心肌组织是基因治疗中的关键问题.目前，外源基因导入哺乳动物细胞的方法大致有生物方法和物理化学方法2种.前者主要以病毒为载体，外源基因在宿主细胞中能长期表达，属当前基因治疗中首选的基因转染方式，但其安全性差、缺乏靶向性等缺点使其应用受到很大限制.后者包括磷酸钙法、显微注射、电穿孔等,因其操作方法限制，不适于大量细胞的转染及基因治疗的在体研究［2］.阳离子脂质体是一种非病毒制剂，由于其具有转染效率相对较高、操作简易、可大规模转染及不引起特异性免

4、疫反应等优点受到大家的关注.本研究应用阳离子脂质体lipofectamine2000将质粒重组体通过局部心肌注射、尾静脉注射、冠状动脉灌注转染3种途径转染至心肌组织，并比较其转染效率，为今后进行心肌组织在体转染的研究提供方法学参考.1材料和方法1.1材料SD雄性大鼠22只，体质量150～200g,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心.pGenesil1质粒及感受态细胞DH5а购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，lipofectamineTM2000及OMEM培养基购自Invitrogen.1.2方法1.2.1pGenesil1质粒重组体的构建质粒重组体pGenesil1的构建参

5、考A：阴性对照组；B：心肌注射组；C：尾静脉注射组；D：冠状动脉灌注转染组；E：冠状动脉灌注转染组升主动脉.图1转染2d时各转染组EGFP的表达×100A：阴性对照组；B：心肌注射组；C：尾静脉注射组；D：冠状动脉灌注转染组；aP<0.05vs阴性对照组;bP<0.05vs心肌注射组和尾静脉注射组.图2各转染组平均荧光强度比较最初基因治疗的途径集中于局部注射于靶器官.早在1990年，alone,RS,MorleG,etal.ExpressionofrebinantgenesinmyocardiuminvivoafterdirectinjectionofDNA［J］.Circ

6、ulation,1990,82(6):2217-2221.［9］LiuD,KnappJE.Hydrodynamicsbasedgenedelivery［J］.CurrOpinMolTher,2001,3(2):192-197.［10］BudkerV，BudkerT，ZhangG,etal.Hypothesis:nakedplasmidDNAistakenupbycellsinvivobyareceptormediatedprocess［J］．GeneMed,2000,2(2)：76-88.［11］MiaoolCellCardiol,2000,32(12):2397-2402.［12

7、］LeeLY,PatelSR,HackettNR,etal.Focalangiogentherapyusingintramyocardialdeliveryofanadenovirusvectorcodingforvascularendothelialgro.