临床医学论文质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性.doc

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1、临床医学论文•质粒重组体在体转染大鼠匕、肌的可行性作者：郭敏，郎明健，曾秋棠，杨汉东，闵新文【摘要］日的：探讨应用阳离了脂质体1ipofcclmninc2000在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性.方法：构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达质粒.将22只雄性SD大鼠随机分为4组：阴性对照组（I组，24），心肌注射组（II组卫二6），尾静脉注射组（HI组二6）和冠状动脉灌注组（IV组，1】二6）•分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染.n〜IV组于转染后2，14d时间

2、点各随机处死3只大鼠，阴性对照组各处死2只大鼠，取心肌组织作快速冰冻切片，荧光显微镜下观察EGFP表达情况.结果：在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，阴性对照组隐约可见淡绿色荧光，第2天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织.各转染组荧光强度与阴性对照组相比,其差异均冇统计学意义（PvO.05）.心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义（P二0.17）.冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强7.37倍（P二0.013）.第2周转染各组荧光强度明显减弱，与阴性对照组差异无统计学意义（P二0.41）.结论：阳

3、离子脂质体lipofectamine2000可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织，而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率.【关键词】脂质体；心肌；转染；质粒；绿色荧光蛋白质类0引言基因治疗为心血管疾病的治疗带來了新的希望〔1〕，如何高效、稳定、安全地将目的基因转染到心肌组织是基因治疗中的关键问题.目前，外源基因导入哺乳动物细胞的方法大致有生物方法和物理化学方法2种.前者主要以病毒为载体，外源基因在宿主细胞中能长期表达，属当前基因治疗中首选的基因转染方式，但其安全性差、缺乏靶向性等缺点使其应用受到很大限制.后者包

4、括磷酸钙法、显微注射、电穿孔等，因其操作方法限制，不适于大量细胞的转染及基因治疗的在体硏究〔2〕.阳离子脂质体是一种非病毒制剂，由于其具有转染效率相对较高、操作简易、可大规模转染及不引起特异性免疫反应等优点受到大家的关注.本硏究应用阳离子脂质体1ipofcctaminc2000将质粒重组体通过局部心肌注射、尾静脉注射、冠状动脉灌注转染3种途径转染至心肌组织，并比较其转染效率，为今后进行心肌组织在体转染的硏究提供方法学参考.1材料和方法1.1材料SD雄性大鼠22只，体质量150〜200g,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心

5、.pGcncsil1质粒及感受态细胞DH5a购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，1ipofeclamineTM2000及OMEM培养基购自Invitrogen・1・2方法1.2.1pGenesi11质粒重组体的构建质粒重组体pGenesi11的构建参考文献〔3〕，本硏究使用U6启动子指导目的基因编码序列的转录及Polin识别的终止信号终止转录，其含有绿色荧光蛋白编码基因及相应的抗性基因.1.2.2质粒脂质体复合物的制备参考lipofcctaminc2000转染说明：将5/zgpGenesi11和10/zL1ipofectam

6、ine2000分别稀释T*OMEM中，总体积各为30“L，室温静置5min，将二者轻柔混合，孵育20min，制成质粒脂质体复合物.1.2.3动物分组及模型建立22只雄性SD大鼠，随机分为4组：阴性对照组（I组，24），心肌注射组（II组,11二6），尾静脉注射组（in组，11=6），冠状动脉灌注转染组（IV组，n二6）・第U组大鼠用200g/L（300mg/kg,ip）乌拉坦联合10g/L戊巴比妥（20mg/kg,ip）复合麻醉，气管插管，呼吸机支持，于左胸第4肋间打开胸腔，充分暴露心脏并剥离心包，将30"L质粒脂质体复合物

7、多点斜行注射到大鼠左室前壁，关胸饲养.第皿组大鼠将30z/L质粒脂质体复合物用900“LOMEM稀释后经尾静脉快速（5s内）注射完全部液体.第IV组同第n组麻醉大鼠，于第3肋间开胸，眼科镑撑开肋间，充分暴露心脏及升主动脉，将30“L质粒脂质体复合物注射于心室，同时用自制无损伤血管钳于升主动脉根部稍远处阻断循坏5s，关胸饲养.U〜IV组于转染后2d，2wk时间点各随机处死3只大鼠，阴性对照组在上述时间各处死2只大鼠.1.2.4荧光显微镜观察大鼠心肌转染效率pGenesi11质粒携带有U6启动子及增强型绿色荧光蛋白编码基因，成功

8、转染后能在细胞内借助U6后动子转录并翻译出绿色荧光蛋白，我们可以通过荧光显微镜直接观察并评估质粒重组体的转染效率.第H组大鼠取出心脏将心尖处局部注射部位取出，其余组将心底部主动脉流出道附近心肌取出，放入冷冻包埋剂屮，低温成型后，冰冻切片机连续切片，片厚10“m，荧光显微镜下以蓝光激发EGF