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1、内耳干细胞培养、移植实验研究论文【摘要】目的通过移植内耳干细胞入中毒性耳聋模型大鼠内耳，观察内耳干细胞的生长、整合等情况。方法选用健康SD大鼠20只，连续10天肌内注射中等度中毒剂量的庆大霉素〔80mg/(kg·d)〕，制作中毒性耳聋动物模型。实验分为2组，每组10只。干细胞组：移植用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记的耳蜗干细胞，观察移植后的内耳干细胞存活、增殖能力；用流式细胞仪测定移植后内耳组织CD4（+）T细胞占整个淋巴细胞的百分比。生理盐水组：耳蜗内注入生理盐水，观察同上。结果与结论移植到中毒性耳聋模型鼠内耳的内耳
2、干细胞能够向周围扩散、存活，而且有一定的增殖能力.freela公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、巢蛋白（nestin）抗体（Sigma公司）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)及其单克隆抗体（Sigma公司）。1.3主要仪器离心机、超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、荧光显微镜、FACSCalibur型流式细胞仪（BD公司）等。1.4中毒性耳聋模型的建立听耳廓反射和前庭功能正常的大鼠给予硫酸庆大霉素肌内注射。选用中等度的中毒剂量80mg/（kg·d），连续使用10天。经听耳廓反射测定器检查判定鼠的听力下降
3、程度以及耳蜗切片观察耳蜗损伤状况，特别是内耳毛细胞崩解的程度，确定造模成功与否。1.5实验分组本实验随机分为2组，每组10只：干细胞组，行干细胞耳蜗内移植；生理盐水组，耳蜗内注入生理盐水。1.6耳蜗干细胞的分离、培养及鉴定1.6.1耳蜗干细胞取材水合氯醛深度麻醉P0大鼠（胚鼠）,无菌操作条件下分离内耳耳蜗。经碘酊、乙醇消毒后固定于烛台,去外膜,在解剖显微镜下操作,剪去动物耳廓及外耳道(外耳道为软骨性),暴露鼓膜,.freelin。中止反应之后加入0.01%DNA酶,吸管轻柔吹打成单细胞悬液。1.6.2耳蜗干细胞培养无血清培养
4、基进行培养〔DMEM/F12(1∶1)液+2%B27+bFGF20μg/L+表皮生长因子（EGF）20μg/L〕。待原代克隆形成后分离克隆制作单细胞悬液，按1×108/L接种培养。7天后将其移至离心管中，500r/min离心,HBSS液洗涤,去上清,余液混匀,涂于多聚赖氨酸包被的载片上,晾干,4%多聚甲醛固定。1.6.3耳蜗干细胞鉴定［1-2］免疫荧光细胞化学染色法,用抗巢蛋白抗体(1∶200)以及BrdU标记内耳干细胞，荧光显微镜下观察并拍照记录。1.7耳蜗干细胞耳蜗内移植将中毒性耳聋模型鼠麻醉后，在无菌条件下，用微量注射
5、器将经BrdU标记的内耳干细胞沿耳蜗壁或者圆窗和卵圆窗注射入内耳耳蜗结构。对照组耳蜗内注射生理盐水，方法同上。1.8取材与观察移植4周后，取大鼠内耳移植部位的组织，剪切，1%胰酶充分消化30min，过滤，离心洗涤5min，弃上清，沉淀以PBS制成细胞悬液，流式细胞仪计数分析。制作实验动物内耳的组织切片及耳蜗铺片，在荧光显微镜下观察内耳组织结构的变化。1.9统计学处理所有数据均采用SPSS软件包进行t检验。P＜0.05为差异有显著性。2结果2.1内耳干细胞的培养及鉴定取自P0大鼠内耳的内耳干细胞在无血清培养基中，镜下观察刚分离
6、的单细胞呈圆形，大小不一，折光性好，悬浮在培养瓶中，无突起长出。培养1天少数细胞伸出突起，3～4天贴壁的细胞突起伸长，5～6天细胞的突起相连交织成网。将离心后的细胞重新制备成单细胞悬液，6～7天后可见大量悬浮的细胞团形成，细胞团中有很多生长状态良好的单个细胞，呈桑葚形状。上述细胞球经巢蛋白免疫荧光鉴定呈阳性，表明分离培养的细胞是具有自我更新能力的干细胞。BrdU特异性标记细胞核，细胞团打散后，可观察到大量BrdU标记阳性的干细胞，说明这些细胞是具有增殖能力的内耳干细胞。继续培养后，有些克隆球自然贴壁，并沿球体周围伸出突起向四
7、周呈放射状延伸。细胞球贴壁后，少数细胞从球体迁移出来，细胞形态不规则，呈三角形、锥形或多角形（图1）。2.2内耳组织CD4（+）T细胞计数用流式细胞仪计数分析，移植后内耳组织CD4（+）T细胞占整个淋巴细胞百分比与移植前差异无显著性〔（48±5）%vs.(45±6)%，P＞0.05〕。2.3内耳的镜下表现在荧光显微镜下：生理盐水组表现为毛细胞核消失，在毛细胞核的位置出现染色空白区；而干细胞组发现有大量BrdU标记阳性的内耳干细胞在移植区域，部分存活的内耳干细胞迁移至耳蜗毛细胞表面,形态上与内、外毛细胞相似（图2）。3讨论Li
8、等［3］在成年大鼠椭圆囊斑位置发现存在内耳干细胞,内耳干细胞在体内和体外培养可分化成毛细胞样细胞，而且拥有高度的增生潜能和自我更新能力［4］。Malgrange等［5］采用无血清培养基加丝裂原性生长因子(EGF或bFGF)从P0大鼠耳蜗和内耳螺旋沟区域分离培养出巢蛋白阳性的神经细胞球,分裂
