内耳干细胞培养、移植实验研究（医学论文）.doc

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1、内耳干细胞培养、移植实验研究【摘要】目的通过移植内耳干细胞入中毒性耳聋模型大鼠内耳，观察内耳干细胞的生长、整合等情况。方法选用健康SD大鼠20只，连续10天肌内注射中等度中毒剂量的庆大霉素〔80mg/(kg-d)L制作中毒性耳聋动物模型。实验分为2组，每组10只。干细胞组：移植用5■漠脱氧尿卩密唳核昔(BrdU)标记的耳蜗干细胞，观察移植后的内耳干细胞存活、增殖能力；用流式细胞仪测定移植后内耳组织CD4(+)T细胞占整个淋巴细胞的百分比。生理盐水组：耳蜗内注入生理盐水，观察同上。结果与结论移植到中毒性耳聋模型鼠内耳的内耳干细胞能够向周围扩散、存活，而且有一定的增殖能力，表现为正常的毛细胞

2、形态；移植后内耳组织CD4(+)T细胞占整个淋巴细胞百分比与移植前差异无显著性〔(48±5)%vs・(45±6)%,P>0・05〕，移植后的排斥反应不明显。【关键词】内耳干细胞培养移植中毒性耳聋动物模型大鼠长期或过量使用链霉素、庆大霉素及丁胺卡那霉素等类药物导致的中毒性耳聋是临床常见的药物副作用。根据国家食品药品监督管理局统计，每年我国因药物造成听力损害的患者高达数百万人。经研究发现其致病机制主要为：耳毒类药如氨基貳类抗生素可抑制ATP酶的活化，使内、外淋巴液中K+、Na+倒置，引起膜通透性改变和多种水解酶释放，最终使内耳毛细胞萎缩、变性、坏死，而且内耳毛细胞损伤通常是不可逆的。近年来，

3、随着神经干细胞研究的不断深入，已有研究表明：内耳损伤后外源基因刺激可以产生新的毛细胞。因而，通过促进耳源性神经干细胞向毛细胞转化，利用其本身的分化特性,重建毛细胞形态和神经连接，恢复毛细胞功能也许是治疗中毒性耳聋的有效途径之一。本实验通过移植内耳干细胞入中毒性耳聋模型大鼠内耳，观察移植后的内耳干细胞生长、整合等情况，为治疗中毒性耳聋提供实验理论依据。1材料和方法1.1实验动物选用健康SD大鼠20只，雌雄不限，体重350〜400g,由南京中医药大学实验动物中心提供。1.2试剂和抗体Neurobasal培养基、E27辅助培养基（GIBCO公司）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF,Sigma公

4、司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、巢蛋白（nestin）抗体（Sigma公司）、5-漠脱氧尿喀喘核昔（BrdU）及其单克隆抗体（Sigma公司）。1.3主要仪器离心机、超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、荧光显微镜、FACSCalibur型流式细胞仪（BD公司）等。1.4中毒性耳聋模型的建立听耳廓反射和前庭功能正常的大鼠给予硫酸庆大霉素肌内注射。选用中等度的中毒剂量80mg/（kg•d）,连续使用10天。经听耳廓反射测定器检查判定鼠的听力下降程度以及耳蜗切片观察耳蜗损伤状况，特别是内耳毛细胞崩解的程度，确定造模成功与否。1.5实验分组本实验随机分为2组，每组10只：干

5、细胞组，行干细胞耳蜗内移植；生理盐水组，耳蜗内注入生理盐水。1.6耳蜗干细胞的分离、培养及鉴定1.6.1耳蜗干细胞取材水合氯醛深度麻醉P0大鼠(胚鼠)，无菌操作条件下分离内耳耳蜗。经碘酊、乙醇消毒后固定于烛台，去外膜,在解剖显微镜下操作，剪去动物耳廓及外耳道(外耳道为软骨性)，暴露鼓膜，透过菲薄的鼓膜可见到听骨链。用盯聆钩沿鼓膜下缘6点处进针,钩住下鼓室部位稍用力迅速将颛骨乳突部连同鼓膜整块摘除,露出鼓岬及其前下方的蜗锥，摘除听骨，刺破两窗膜(圆窗和卵圆窗),用眼科剪剪开耳蜗前方的薄层骨连接至颅内，通过此口用肛聆钩入颅内向后外方骨折取出完整的内耳标本,剪去连接的颛肌，找到大鼠耳蜗内螺旋沟

6、及内毛细胞下方区域并取材。HESS液冲洗几次后剪碎,加入0.125%胰蛋白酶37°C消化30Ulin。中止反应之后加入0.01%DNA酶，吸管轻柔吹打成单细胞悬液。1.6.2耳蜗干细胞培养无血清培养基进行培养［DMEM/F12(1:1)液+2%B27+bFGF20yg/L+表皮生长因子(EGF)20yg/L〕。待原代克隆形成后分离克隆制作单细胞悬液,按1X108/L接种培养。7天后将其移至离心管中，500r/min离心，HESS液洗涤，去上清，余液混匀，涂于多聚赖氨酸包被的载片上,晾干，4%多聚甲醛固定。1.6.3耳蜗干细胞鉴定［1-2］免疫荧光细胞化学染色法,用抗巢蛋白抗体(1:200

7、)以及BrdU标记内耳干细胞，荧光显微镜下观察并拍照记录。1.7耳蜗干细胞耳蜗内移植将中毒性耳聋模型鼠麻醉后，在无菌条件下，用微量注射器将经BrdU标记的内耳干细胞沿耳蜗壁或者圆窗和卵圆窗注射入内耳耳蜗结构。对照组耳蜗内注射生理盐水，方法同上。1.8取材与观察移植4周后，取大鼠内耳移植部位的组织，剪切,1%胰酶充分消化30min,过滤，离心洗涤5min,弃上清，沉淀以PES制成细胞悬液，流式细胞仪计数分析。制作实验动物内耳的组织切片