丁苯酞干预对大鼠脑缺血再灌注神经保护的研究

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1、丁苯酞干预对大歐脑缺血再灌注神经保护的研究张林艳1林清2周杜娟1（1福州神经精神病防治院神经内科350008；2福建医科大学基础医学院350108）【摘要】目的观察丁苯肽对大鼠脑缺血再灌注神经保护的作用。方法将30只大鼠分成假手术组（10只）、模型组（10只）、干预组（10只）。Longa法线栓法制备大鼠缺血再灌注模型。缺血2小时再灌注24小时后对各组大鼠进行神经功能缺损评分，TTC染色观察脑梗死灶面积，免疫组化法检测caspase-3的表达变化。结果干预组、模型组与假手术组对比，脑梗死灶的caspase-3阳性细胞增加；丁苯酞干预组与模型组对比：1、神经

2、功能缺损程度比减轻，2、脑梗死灶体积减小，3、caspase-3阳性细胞表达减少。结论丁苯肽对大鼠脑缺血有一定的预防作用。【关键词】丁苯醜脑缺血脑梗死面积caspase-3【中图分类号】R743【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）44-0093-02缺血性脑血管病是危害人类健康的常见病，A有较高的致残率和致死率。脑缺血再灌注损伤主要的发病机制之一是细胞凋亡[1],因此抗凋亡是治疗缺血性脑血管病的新靶点。1材料与方法1.1实验动物健康Sprauge-Dawley雄性大鼠，体重250-300克，购自中国科学院上海实验动物中心SCXK（泸）

3、：2007-0005,自由饮食，室温22-25°C,每日光照12h。线栓（直径0.26mm）。1.2实验材料TTC染色剂（Sigma,美国），DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司，丁苯肽胶囊（0.2克/粒，石药集团恩必普药业有限公司生产），4-0尼龙卑线，兔抗大鼠caspase-3抗体购自Bioworldtechnology公司。1.3实验方法1.3.1模型制备模型制作根据Longa法［2］进行改良。10%水合氯醛腹腔麻醉，参照Longa线栓法，加以改进，自制直径为0.26mm的尼龙线栓子制备大鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)。缺血2h后拔除尼龙线

4、10mm,造成脑缺血再灌注损伤模型。假手术组除不插入栓线外，其余手术过程皆同大脑中动脉线栓模型手术。神经病学评分采用Longa5级4分法：1分〜3分为模型成功标志，首次评分为0分或4分、有呼吸困难、提前死亡及处死时发现冇蛛网膜下腔出血的动物均弃之不用。1.3.2给药方法将丁苯酞胶囊用生理盐水稀释成药物浓度为8mg/ml混悬液，干预组术前5d开始以80mg/kg丁苯酞灌胃，假手术组和模型组给予等剂量生理盐水灌胃。连续灌胃2周。1.3.3TTC染色每组随机取5只大鼠，断头取脑，用排刀从前极开始每隔2mm行冠状切片，共5片。置于2%氯化-2.3.5-三笨四氯唑(

5、TTC)溶液，37°C避光染色30min,正常脑组织被染成玫瑰红色，梗塞灶为白色。转至10%福尔马林固定，用数码相机拍摄。利用图像分析法计算各个脑片梗死面积。1.3.4免疫组织化学石蜡切片常规脱蜡至水，过氧化氢封闭，抗原热修复20min，血清封闭，抗体稀释液1:100稀释caspase-3抗体，滴加caspase-3抗体，4°C孵育过夜，次曰室温复温30min，移去caspase-3抗体，PBS冲洗，DAB显色，脱水透明封片，显微镜观察。阳性细胞胞浆呈棕黄色，于阳性细胞分布区随机选择5个不重复的高倍镜(10×40)视野，计算caspase-3阳

6、性细胞率。1.4统计学处理所获数据均为正态分布，采用x-&PlUSmn;S表示，SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析和t检验。2结果2.1神经功能缺损评分及脑梗死面积测定见（表1）表1丁苯酞对大氣脑组织梗死面积及神经功能缺损评分的影响组别n梗死面积（mm2）神经功能缺损评分/分假手术组10010.28±0.071模型组1026.38±5.161.78±0.46干预组1017.52±4.2121.19±0.222注：与模型组相比，1P<0.01,2P<0.05o2.2免疫组化检测ca

7、spase-3表达假手术组caspase-3阳性细胞仅少数表达，模型组caspase-3阳性细胞表达的数量较多；干预组caspase-3阳性细胞数量比模型组减少。（见图1）图1caspase-3阳性细胞在各组脑组织内表达阳性率的比较假手术组模型组干预组3讨论脑组织发生缺血性改变后，梗死灶中心以细胞死亡为主，而在梗死灶边缘;Caspase家族是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶，Caspase-3是半胱天冬酶家族成员之一，参加细胞凋亡信号，它是各种细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，是凋亡的关键酶和执行者，同时也是许多神经细胞凋亡的重要效应蛋白；在各种程序启动的凋亡程

8、序中起最后枢纽的作用。丁苯酞有效成分均为消旋-3-正丁基苯酞（NB