rphplc法测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量

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1、RPHPLC法测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量【摘要】　　目的建立测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚含量的方法。方法采用反相高效液相色谱法：色谱柱为UltimateTMAQC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以甲醇水(体积比45∶55)为流动相，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长274nm。结果丹皮酚的质量浓度在1.024～25.60μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r=0.9990，n=5),平均回收率103.3%，RSD为1.5%。结论该方法准确、专属性强、重复性好，可用于测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量。【关键词】光合细菌六味地黄汤丹皮酚　　

2、六味地黄汤由宋代名医钱乙首创，是中医著名的滋补肾阴传统代表方剂，由熟地、山茱萸、山药(三补)和泽泻、丹皮、茯苓(三泻)所组成[1]，主治肾阴不足证，从古到今在中医临床广为应用[2]。本实验室在前期研究中，探索性地将光合细菌引入到经典方剂六味地黄汤中，利用光合细菌自身的营养成分及其生物转化功能，达到提高药效的目的。药理实验结果表明，六味地黄汤经光合细菌代谢后，在增强免疫、抗衰老[3]和治疗肾阴虚证模型小鼠等方面的作用均优于传统的六味地黄汤[4]。本文建立测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚含量的RPHPLC法，为进一步有效控制其质量提供实验依据。　　1仪器与试药　　1.1仪器　　AQ

3、C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm);流动相为甲醇水(体积比45∶55)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长274nm，进样量10μL。取PSB溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液与供试品溶液各10μL进样，结果表明，丹皮酚色谱峰分离度良好，理论塔板数以丹皮酚计算不低于3000，分离度大于1.5，阴性对照品无干扰，见图1。　　2.3线性关系的考察　　精密吸取“2.1.1”项对照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、25.0mL置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制得质量浓度为1.024、5.120、10.240、15.360、25.600μg/mL

4、的对照品溶液，分别进样10μL，在“2.2”项色谱条件下，测定丹皮酚的峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y=97278X-19986,r=0.9990，表明丹皮酚质量浓度在1.024～25.60μg/mL范围内与峰面积具有良好线性关系。　　2.4精密度试验　　精密吸取同一对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样10μL，平行测定5次，测得丹皮酚平均峰面积为635245，RSD为1.20%。　　2.5稳定性试验　　精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于配制后0、2、4、8、12、24h进样，按“2.2”项下色谱条件测定，测得样品中丹皮酚平均质量浓

5、度为13.54μg/mL，RSD为0.63%。表明供试品溶液在24h内稳定。　　2.6重复性试验　　称取同一批样品6份，按“2.1.2”项制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件测定，测得样品中丹皮酚平均含量为13.55μg/mL,RSD为0.95%，表明样品重现性良好。　　2.7加样回收率试验　　取5份已知含量的供试样品25mL，加入一定量丹皮酚对照品，按“2.2”项色谱条件进行测定，以外标法计算丹皮酚的含量并计算丹皮酚的回收率，结果平均回收率为103.31%，RSD为1.5%,结果见表1。表1加样回收率试验结果　　2.8样品含量测定　　取3批样品，按“2.1.2”项方法制备样品

6、溶液，分别精密吸取供试溶液和对照品溶液各10μL，按“2.2”项色谱条件进样测定丹皮酚峰面积，采用外标一点法计算样品溶液中丹皮酚的含量，3批样品测定结果分别为13.50μg/mL、13.40μg/mL、13.40μg/mL，平均含量为13.43μg/mL。　　3讨论　　3.1试验中曾试用过三氯甲烷和无水乙醇作为提取丹皮酚的溶剂进行超声萃取，结果表明，三氯甲烷提取的回收率仅为40%，明显低于乙醇提取的回收率(105.0%)，故以乙醇作为光合细菌代谢六味地黄的丹皮酚的提取溶剂。　　3.2本方法具有分离效果好、准确性高等优点，可用于六味地黄汤生物制剂中的丹皮酚含量测定。【参考