超声波辅助ureafree试剂结合热变性快速酶解蛋白质论文

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1、超声波辅助UreaFree试剂结合热变性快速酶解蛋白质论文李雅萍李友元周新文陈长华张嗣良杨芃原【摘要】建立了一个超声功率超声时间的安全区域，在此范围内进行超声波辅助酶解时，能避免超声波随机断裂蛋白质;在此安全区域内采用响应面法获得最佳超声功率和超声时间。建立了超声波辅助UreaFree试剂结合热变性快速酶解蛋白质的方法，将蛋白质依次进行10min超声波浴辅助UreaFree还原烷基化反应、90℃热变性15min，超声波辅助胰蛋白酶酶解15s。应用此快速酶解方法鉴定3种典型标准蛋白质(牛血清白蛋白、细胞色素C和肌红蛋白)，在25min内达到与传统整夜酶解方法

2、相同的鉴定结果，并获得更高的序列覆盖率。【关键词】超声波辅助;热变性;蛋白质;酶解;质谱1引言目前，用于蛋白质鉴定的方法主要有二维电泳质谱法和多维色谱质谱法1。两种方法在酶解后均需要一系列化学处理和提取、纯化步骤以回收酶解碎片.freelicsgrade)购自Sigma公司。SDSPAGE常用试剂(Merck公司)。混合蛋白质标准样品(TaKaRa公司)。2.2实验方法2.2.1配制标准蛋白质溶液用25mmol/LNH4HCO3溶液分别配制20mmol/L二巯基苏糖醇(DTT)溶液和100mmol/L碘乙酰胺(IAA)溶液，并制得浓度为20g/L各标准蛋白质

3、溶液。2.2.2蛋白质变性传统试剂变性过程：在蛋白质样品中加入16mol/L尿素溶液和20mmol/LDTT溶液，使尿素和DTT终浓度分别为8mol/L和10mmol/L;37℃恒温1h;加入100mmol/LIAA溶液,使IAA终浓度为DTT终浓度的5倍，于暗处室温反应45min。热变性过程：蛋白质样品在90℃水浴中保温15min。Ureafree试剂结合热变性过程：在无尿素参与下，蛋白质样品经DTT和IAA还原烷基化反应后，再进行热变性;超声波浴辅助变性过程：使用超声波清洗器(功率180ALDITOFMS分析酶解后的样品用0.8μL饱和基质溶液(α氰基

4、4羟基肉桂酸，0.1%TFA，50%乙腈配制)混合，点样后吹干，用4700型MALDITOFMS检测，根据S/N≥20输出质谱数据，利用Mascot的肽指纹谱(Peptidemassfingerprint,PMF)进行检索，允许漏切位点(Missedcleavages)的最大数为1，肽谱中质量偏差±0.1Da，数据库选择Serangeforultrasonication含有9个标准蛋白质的混合蛋白质样品经传统试剂变性后，在没有胰蛋白酶作用的条件下进行不同时间和功率的超声作用。经SDSPAGE分离检测后，蛋白质条带明显消失或蛋白质含量明显下降的超声条件视为

5、非安全区域。建立的超声功率和超声时间的安全区域见图1中斜线部分。在安全区域内，蛋白质分子经超声后基本不发生随机断裂。3.1.2超声条件的响应面优化在安全区域内进行两水平的响应面设计以优化超声功率和超声时间。响应面设计见表1(根据超声波仪器功率设置的精度，将各变量的设计值取整后进行实验)。通过式(1)计算酶解效率。表1响应面设计表Table1Schemeofresponsesurfacedesign序号Run功率Poe(s)序号Run功率Poe(s)125.030817.520217.534917.520310.0301017.56428.0201125.01057

6、.0201210.010617.5201317.520717.520图2响应面结果的三维(3D)立体图Fig.2Threedimensionplotofresponsesurfacedesignresults响应面3D结果如图2所示。模型的“ProbF”值为0.0243，明显小于0.05，说明模型拟合是显著的。求解拟合方程得到各因子的推荐值为：功率22.53F搜库结果显示能正确鉴定蛋白质。蛋白质序列覆盖率和匹配的肽段数目与传统的12h酶解方法接近，结果见表2。表2BSA在传统与超声波辅助酶解方法下序列覆盖率、匹配肽段数目和得分比较3.2超声波浴辅助UreaFre

7、e试剂结合热变性快速变性蛋白质3.2.1尿素、还原烷基化试剂及热变性对蛋白质酶解效率的影响虽然尿素是有效的变性剂，但其易分解生成异氰酸盐，在样品制备过程中会导致赖氨酸和半胱氨酸残基上发生人为的氨甲酰化,进而降低氨基酸序列覆盖率和蛋白质鉴定效率11。因此，拟采用热变性取代尿素变性。单纯使用热变性取代全部试剂变性时，部分蛋白质酶解程度不佳，因此在采用Ureafree试剂结合热变性蛋白质之前，应该先考察各因素对酶解效率的影响。细胞色素C在溶液中酶解时对酶解条件非常敏感9，采用其作为评估蛋白质。实验结果见表3。4#和5#数据显示，在IAA参与下，不使用尿素同样能够达到1

8、00%酶解