超声波辅助Urea-Free试剂结合热变性快速酶解蛋白质.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2010年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry663～667DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．00663超声波辅助Urea—Free试剂结合热变性快速酶解蛋白质李雅萍李友元周新文陈长华张嗣良杨芄原(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237)(复旦大学生物医学研究院，上海200032)摘要建立了一个超声功率一超声时间的安全区域，在此范围内进行超声波辅助酶解时，能避免超声波随机断裂蛋白质；在此安全区域内采用响应面法获得最佳超声功率和超

2、声时间。建立了超声波辅助Urea—Free试剂结合热变性快速酶解蛋白质的方法，将蛋白质依次进行10min超声波浴辅助Urea—Free还原烷基化反应、90℃热变性15min，超声波辅助胰蛋白酶酶解15S。应用此快速酶解方法鉴定3种典型标准蛋白质(牛血清白蛋白、细胞色素C和肌红蛋白)，在25rain内达到与传统整夜酶解方法相同的鉴定结果，并获得更高的序列覆盖率。关键词超声波辅助；热变性；蛋白质；酶解；质谱1引言目前，用于蛋白质鉴定的方法主要有二维电泳一质谱法和多维色谱．质谱法¨j。两种方法在酶解后均需要一系列化学处理和提取、纯化步骤以回收酶解碎片，冗长的样品制备

3、过程增加了损耗和污染蛋白质的风险。目前，有关减少蛋白质鉴定前样品预备的时间的方法较多，这些方法主要专注于提高样品处理的通量，基于在酶解步骤中提高温度、使用含有流动胰蛋白酶的柱、加入有机溶剂、用超声波和微波增强胰蛋白酶活性等。Capelo等采用高强度聚焦超声波辅助胰蛋白酶快速酶解蛋白质。Park等在蛋白质酶解和质谱分析之前进行蛋白质的热变性，但在热变性过程中蛋白质易聚集，因而未能被广泛采用。本研究综合考察热变性、非尿素试剂变性和超声波辅助等多因素对蛋白质溶液中酶解效率的影响，克服了单因素存在的缺陷；简化了样品预处理步骤，节省了时间，建立了高效率和高通量的蛋白质酶

4、解方法。2实验部分2．1仪器与试剂4700MALDI—TOF—MS(AXIMAQIT，日本岛津公司)，JY92一II型超声波破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；DL一180A超声波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂)；UP50H手持式超声波处理器(德国Hielscher公司)；GDS．8000凝胶成像仪(美国UVP公司)；DY—A电泳仪(上海西巴斯生物技术开发有限公司)。蛋白质组学常用试剂、标准蛋白质及胰蛋白酶(Proteomicsgrade)购自Sigma公司。SDS—PAGE常用试剂(Merck公司)。混合蛋白质标准样品(TaKaRa公司)。2．2实验方法

5、2．2．1配制标准蛋白质溶液用25mmol／LNHHCO溶液分别配制20mmol／L二巯基苏糖醇(D1Tr)溶液和100mmol／L碘乙酰胺(IAA)溶液，并制得浓度为20g／L各标准蛋白质溶液。2．2．2蛋白质变性传统试剂变性过程：在蛋白质样品中加入16mol／L尿素溶液和20mmol／LDTF溶液，使尿素和DTF终浓度分别为8mol／L和10mmol／L；37℃恒温1h；加入100mmol／LIAA溶液，使IAA终浓度为DTT终浓度的5倍，于暗处室温反应45min。热变性过程：蛋白质样品在90℃水浴中保温15min。Urea—free试剂结合热变性过程：在

6、无尿素参与下，蛋白质样品经DTF和IAA还原烷基化反2009-10-20收稿；2009．12—11接受本文系国家科技支撑计划项目(No．2008BAI63B01)、生物反应器工程国家重点实验室专项经费(No．2060204)资助E-mail：yyli@eeust．edu．cn分析化学第38卷应后，再进行热变性；超声波浴辅助变性过程：使用超声波清洗器(功率180W，频率40／60kHz)作为超声波浴，蛋白质样品的各种变性过程在超声波浴中完成。2．2．3溶液中蛋白质酶解在100IxL0．1g／L变性后的蛋白质样品中加入胰蛋白酶(W(底物)：W(酶)=40：1)，按

7、照下述两种方法进行酶解。(1)传统蛋白质酶解方法：将上述蛋白质样品在37℃下酶解12h。(2)超声波辅助酶解方法：将上述蛋白质样品放置冰浴中，以工作5S间歇5S的方式进行超声作用，采用的探头直径为2mm。煮沸2～3min，中止酶解反应。2．2．4SDS—PAGE分析采用5％浓缩胶和14％分离胶分析样品，用凝胶电泳图像分析系统分析数据。酶解效率较高时，酶解后凝胶中样品条带消失或积分光密度(IOD)明显减少。在每张凝胶上都以相同蛋白质浓度的未经过处理的标准蛋白质样品为对照。酶解效率用蛋白质酶解相对百分比(Relativepercentageofproteindig

8、estion，％)来衡量，计算公式：R