小鼠胚胎原始性细胞中基因body区甲基化与表达的相关性研究

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1、小鼠胚胎原始性细胞中基因body区甲基化与表达的相关性研究1、绪论1.1DNA甲基化概述细胞中DNA的甲基化修饰是最常见的基因表观修饰方式之一，可以在不改变基因序列的前提下发挥调控蛋白表达以及发育过程的作用[1]。哺乳动物中大部分的DNA甲基化修饰发生在CpG双核苷酸的胞嘧啶(cytosine，C)的第五号碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）；也有报道在人的胚胎发育早期，大量的DNA甲基化修饰发生在CHG序列上（这里H指A、C、T）[2]。在基因组中，CpG有两种存在形式，一种是分散在DNA序列中，另一种

2、是高密度的CG双核苷酸聚集在一起，CG含量大于50%且长度大于200bp时，我们称之为CpG岛（CGI）[3]，哺乳动物中有50%以上的基因都包含有CGI。经典的理论认为，DNA的甲基化与基因的表达呈负相关，这主要是由于启动子区的甲基化程度直接影响着这部分DNA的构象，高度的甲基化可以阻止转录因子的结合，进而影响了基因转录的起始。但是近年来，研究者开始关注转录起始区新的甲基化与基因沉默的先后时间顺序，即它们是同时进行还是一个在先、一个在后。DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶来催化完成。目前，在真核生物中

3、发现了3类DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3l)。先前认为，Dnmt1是一种维持性甲基化酶；Dnmt2可与DNA上特异位点结合，但具体作用尚不楚；Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3l是重新甲基化酶，它们使去甲基化的CpG位点重新甲基化，即参与DNA的从头甲基化(denovomethylation)。在哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎期，其基因组范围内的甲基化谱通过了大规模的去甲基化和接下来的再甲基化过程发生重编程，从而产生具有发育潜能的细胞；在胚胎的发

4、育时期，同样是这些重新甲基化酶参与DNA甲基化谱的构建。新的研究发现，甲基化倾向于发生在核小体的部位，且中间缠绕的组蛋白的修饰可以影响这些甲基转移酶的作用[4]。而且还发现，Dnmt1对甲基化的维持不是独立的，它需要Dnmt3a和Dnmt3b的共同参与[5]。在胚胎干细胞中还发现有完全的去甲基化状态[6]，但在正常体细胞或者癌细胞中都没有发现有完全的去甲基化[7,8]。既然甲基可以由酶加到DNA上，甲基化的胞嘧啶在基因表达过程中也会主动或者被动地去甲基化。人们致力于寻找特定的去甲基化酶，均以失败而告终[9]

5、。但后来证实确实有去甲基化酶的存在[10,11]，它们可以将5mC氧化成5-羟甲基胞嘧啶。虽然有人发现，在实现活性去甲基化以后细胞在经历分裂或者DNA修复以后，直接去除掉了该碱基而不是去掉甲基基团[12,13]。现在发现很多氧化酶类，像TET、AID和TDG等，在去甲基化和基因的激活方面发挥着重要作用[12,14-17]。比如TET3缺乏可以导致Oct4或者Nanog不能去甲基化从而推迟胚胎的形成[18,19]。总而言之，DNA的甲基化与DNA序列和其他表观修饰一起共同参与基因调控。在细胞分化的过程中，基因

6、的甲基化状态还可以遗传给后代细胞。基于DNA甲基化改变与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题[20]，DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。1.2启动子区甲基化1.2.1包含CGI的基因启动子基因启动子区的CpG密度存在两极化，即一部分基因的启动子区CpG密度很高（包含CGI），而另一部分基因启动子CpG密度很低，但也还是存在少量的中间密度的基因。在体细胞中，转录激活的基因启动子区的CGI大部分是处于未甲基化状态，这些基因转录起始区常常是无核小体存

7、在的，在转录因子的调控[21]下这些含有未甲基化CGI的启动子可以起始下游基因的转录，而起始区两边的核小体常常包含组蛋白变体H2A.Z且伴随H3K4me3的组蛋白修饰[21]；而含有CGI的基因在转录受抑制时，例如在polyb复合体调控下[22]转录起始区常常形成核小体且伴随有H3K27me3的组蛋白修饰和MeCP2（methyl-CpG-bindingprotein2）的结合。但这并不说明启动子的CGI不会被甲基化。一部分基因启动子区的甲基化CGI一般认为与基因的长期沉默有关，例如基因印记、X染色体失活等

8、，或者是在特定的组织中某些基因的启动子CGI表现为不同程度的甲基化。据统计，人类基因组转录调控区CGI的甲基化状态与56%的编码基因相关，因此大多数的研究都集中于基因转录调控区尤其是CGI甲基化的改变。1.2.2不含CGI的基因启动子还有一部分基因启动子不含CGI，它们的甲基化状态波动性很大。在原始性细胞中表达的这些基因转录起始位点都是未被甲基化的；而在胚胎干细胞或者组织特异性表达的基因中其启动子区，在精细胞中被