小鼠早期胚胎发育过程中细胞凋亡及凋亡基因表达的检测_李威

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1、细胞生物学杂志ChineseJournalofCellBiology2006,28:596-602http://www.cjcb.org小鼠早期胚胎发育过程中细胞凋亡及凋亡基因表达的检测李　威　王连卿　苏静艳　袁丽丽　严云勤*(东北农业大学动物组织胚胎教研室，哈尔滨150030)摘要　　小鼠早期胚胎发育过程中凋亡现象大量存在，细胞凋亡与凋亡基因表达有关。应用彗星电泳法检测小鼠早期胚胎凋亡情况；应用巢式RT-PCR、免疫组化的方法检测了Bcl-2家族成员(Bax、Bcl-2、Bak、Bcl-xl)的表达变化情况。结果显示：随着胚胎细胞数目的增加，凋亡比率逐渐增大；Bax表达量在整个过程中基本不

2、变，Bcl-2表达量逐渐上调，Bak、Bcl-xl的表达量逐渐降低。对小鼠早期胚胎发育过程中的基因表达研究对于揭示早期胚胎发育的机制有重大的意义。关键词　　早期胚胎发育；凋亡；基因表达在哺乳动物中，大约有30%~70%的胚胎在发状条带相同，检测的目标是凋亡所形成的180~220育过程中夭折，其中绝大部分发生在胚胎发育的早bp或其整数倍的片段，但克服了后者需要大量提取期。胚胎死亡的原因很复杂，可能与遗传、环境等DNA缺点，而且彗星电泳法较传统的用于凋亡检测因素有关，胚胎细胞凋亡是胚胎夭折的主要方式[1]。的TUNEL法而言更加经济、迅速，而且能够避免诱发胚胎细胞凋亡的原因很多，受精过程的异常[

3、2]、坏死细胞对结果的影响。但彗星电泳的方法在胚胎胚胎发育过程中温度的不稳定[3]、不适宜的生长因中应用也存在一定的缺点，这种方法只能检测胚胎子水平[4]、细胞内基因的非正常表达[5~7]等，都可当中是否发生了凋亡以及凋亡发生的程度，对于凋能诱发胚胎细胞发生凋亡。亡发生的位置不能够加以确定。在胚胎发育过程中，发生严重凋亡的胚胎在细胞凋亡的发生是受到一系列基因表达调控形态上常表现为碎裂，通过染色可以检测到凋亡小的，胚胎细胞的凋亡同样是多个调节基因作用的共同结果[10]。在对多种体细胞当中凋亡通路的研究发体。这与在体细胞当中凋亡的形态学特征类似，主要是由于内源性核酸酶激活后切割DNA，导致染现，

4、尽管细胞种类及诱导凋亡发生的原因各有不色质片段化并最终凝集形成凋亡小体[8]。胚胎是一同，但凋亡的发生都与凋亡基因的表达密切相关。个多细胞的整体，在某些形态上正常的胚胎当中也参与细胞凋亡的蛋白质及蛋白质家族很多，但由于存在着凋亡细胞，而这些胚胎与正常未发生凋亡的胚胎细胞数目稀少，这些蛋白质的表达情况不容易胚胎从外观上很难区分。由于在这些胚胎的凋亡细检测。传统的RT-PCR的方法需要大量胚胎来提取胞当中也同样发生了内源性核酸酶的激活及染色体实验所需的mRNA模板。Western印记虽然灵敏性的剪切，通过彗星电泳[9]、TUNEL染色等方法[1]就较高，但也面临着需要消耗大量胚胎的问题。而且可以

5、检测到这些形态正常的胚胎中的凋亡信号。这种方法只能检测多个胚胎发育过程中整体的蛋白TUNEL染色是现在公认的能够检测原位凋亡的质表达状况，对单个胚胎当中的蛋白质表达情况则方法之一，其原理是通过末端转移酶，将标记的无法检测。dUTP连接到内源性核酸酶切割DNA所产生的平端早期胚胎发育过程中的凋亡现象及蛋白质表达上。此方法灵敏度高，但结果容易受到坏死细胞规律对于胚胎的发育过程至关重要，直接影响到胚和细胞分裂时产生的单链DNA的影响，且试剂较胎发育方向。为此，我们着力于改进实验方法，对为昂贵。彗星电泳最先被用于培养细胞中单个细胞早期胚胎发育过程中的凋亡情况以及在胚胎发育过的凋亡情况分析，近几年逐渐

6、被用于胚胎细胞凋亡收稿日期：2005-11-04　　接受日期：2006-04-14的研究。其原理与检测细胞凋亡的传统的DNA梯*通讯作者。Tel:0451-55190846,E-mail:yanyunqin@sohu.com李　威等：小鼠早期胚胎发育过程中细胞凋亡及凋亡基因表达的检测597程中蛋白质的表达规律做了进一步的研究。以昆明NaCl、27mmol/LKCl、5mmol/LCaCl2、0.5mmol/白小鼠胚胎为实验模型，对小鼠早期胚胎细胞凋亡L葡萄糖、pH2.0)中处理1min，去透明带。放入情况以及在胚胎发育早期表达的4个Bcl-2家族分子事先用1‰DEPC浸泡24h，而后高压灭菌

7、烘干的(Bax、Bcl-2、Bak、Bcl-xl，其中Bax和Bak为促薄壁离心管中，在向其中加入4ml裂解液[0.5%凋亡基因；Bcl-2和Bcl-xl为抑凋亡基因)的表达情NP40、10mmol/LTris(pH8.0)、10mmol/LNaCl、况进行检测，研究了它们在早期胚胎发育过程中的3mmol/LMgCl2，DEPC灭菌水配制]、1mlDNase、表达规律。1mlDNase缓冲液、1mlRNA酶抑