内皮素1串联体的构建及其在cos7细胞中的表达鉴定论文

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1、内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的表达鉴定论文【摘要】目的：克隆、表达内皮素1(endothlin1,ET1)串联体，提高ET1的免疫原性及其免疫机体后产生抗体的效价.方法:通过pGEX4T1载体对ET1的基因进行了串联，并在ET1串联基因下游引入GMCSF基因，酶切鉴定及序列分析构建重组质粒；再将含有ET1串体与GMCSF的融合基因连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，同样经过酶切鉴定及序列测定证实；并对构建表达载体转染COS7细胞，应用间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因在COS7细

2、胞中的表达情况.结果:正确构建了ET1重复序列4串体基因与GMCSF基因重组的克隆载体pGEXET1④GMCSF以及真核共表达质粒pcDNA3.1ET1④GMCSF；间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因ET1和GMCSF在COS7细胞中都得到了表达.结论：内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的成功表达将对ET1的免疫学特性、核酸疫苗的研制以及相关自身疾病免疫治疗的进一步研究奠定基础.【关键词】内皮素1COS7细胞自体免疫0引言内皮素1（endothelin1,.freelidMinipre

3、pKit购自Omega公司；核酸凝胶纯化试剂盒NucleoTrapRGelExtractionKit购自Clontech公司；鼠抗人ET1单抗隆抗体为Oncogene公司产品，人ET1为Sigma公司产品，荧光抗体羊抗鼠IgGFITC购自华美公司；限制性内切酶类，DL2000，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；丙烯酰胺，NN甲叉双丙烯酰胺，TEMED，SDS及Agrose等购自BioRad公司；Trisbase为Promega公司产品；小牛血清购自Gibco公司；RPMI1640培养液为Sigma公司产品；

4、低分子量标准蛋白质购自上海丽珠东风生物技术有限公司产品；其余均为国产分析纯试剂.1.2方法1.2.1ET1基因片段的合成委托北京奥科生物技术有限公司合成两端带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的片段F1GATCCTGCTCCTGCTCTTCCCTGATGGATAAAGAGTGTGTCTACTTCTGCCACCTGGACATCATCTGGAGATCTTGAG(78mer)；F2TCGACTCAAGATCTCCAGATGATGTCCAGGTGGCAGAAGTAGACACACTCTTTATCCATCAGGGAAGAGCAGGAGC

5、AG(78mer).1.2.2合成片段F1与F2的退火F1和F2用灭菌双蒸水溶解至100pmol/μL，取适量按常规方法沸煮3min，自然降至室温.1.2.3与克隆载体pGEX4T1的连接pGEX4T1经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的回收片段与上述退火产物在T4DNA连接酶作用下进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，铺LB平板37℃孵箱中培养过夜，挑取单菌落扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定及序列分析,得到pGEXET1单体（pGEXET1①）.1.2.4ET1基因的串联取序列正确的质粒pGEXET1①的菌体扩大

6、培养，提取质粒，一份经BamHⅠ和SalⅠ双切回收小片段，另一份经BglⅡ和SalI双切回收大片段，大小片段连接即得ET1二串体（pGEXET1②）；同上酶切回收pGEXET1②的大片段和pGEXET1②的小片断，连接即可得到ET1④串体（pGEXET1④）,并进行酶切及序列分析测定.1.2.5GMCSF基因的克隆设计引物Pgf和Pgr，并引入Linker和相应酶切位点：Pgfattagatctggatccggtggttcagcacccgcccgctcgcccag(44mer),Pgrtcctcgagtcact

7、cctggactggctcccag(30mer).以Pgf,Pgr为引物,以本实验室保存的pGEM3zfGMCSF为模板进行PCR扩增，回收产物进行序列分析.测序正确的PCR产物经BglⅡ和XhoI双酶切后回收.1.2.6构建重组克隆及表达质粒回收经BglⅡ和XhoⅠ双酶切的GMCSF产物及测序正确的用同样双酶切的pGEXET1④载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，铺板培养，挑取单菌落扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定及序列分析.取测序正确的pGEXET1④GMCSF重组质粒用BamHⅠ和XhoⅠ

8、双酶切的目的片段连接到经同样双酶切的pcDNA3.1载体中，构建重组的pcDNA3.1ET1④GMCSF真核表达载体,挑取单菌落并扩增，提取质粒进一步进行酶切及序列鉴定.1.2.7细胞培养COS7细胞用含100mL/LFCS的DMEM培养于100mL细胞培养瓶，约75％长满时，用2.5g/L胰酶+0.2g/L