内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的表达鉴定_医学论文

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1、内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的表达鉴定_医学论文内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的表达鉴定_医学论文【摘要】目的：克隆、表达内皮素1(endothlinl,ET1)串联体，提高ET1的免疫原性及其免疫机体后产生抗体的效价.方法：通过pGEX4T1载体对ET1的基因进行了串联，并在ET1串联基因下游引入GMCSF基因，酶切鉴定及序列分析构建重组质粒；再将含有ET1串体与GMCSF的融合基因连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)中，同样经过酶切鉴定及序列测定证实；并对构建表达载体转染COS7细胞，应用间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因在COS7细

2、胞中的表达情况.结果：正确构建了ET1重复序列4串体基因与GMCSF基因重组的克隆载体pGEXET1④GMCSF以及真核共表达质粒pcDNA3.1ET1④GMCSF；间接免疫荧光法及ELISA检测表明0的基因ET1和GMCSF在COS7细胞中都得到了表达.结论：内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的成功表达将对ET1的免疫学特性、核酸疫苗的研制以及相关自身疾病免疫治疗的进一步研究奠定基础.【关键词】内皮素1COS7细胞自体免疫0引言内皮素1(endothelinl,ET1)是1988年由Yanagisawa等[1-2]从培养的猪主动脉内皮细胞上清液中分离纯化出的一种小

3、分子血管收缩肽，广泛分布于神经系统、循环系统和内分泌系统等，具有广泛的生物学活性，作为强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原参与心肌缺血、高血压脑卒中以及肾衰等许多疾病的发病过程[3]・本文将ET1基因串联构建ET1④串体并与GMCSF基因融合，构建pcDNAET1GMCSF真核表达载体，并对重组质粒在COS7细胞中的表达进行了鉴定，旨在增加ET1的免疫原性，制备高滴度的ET1抗体；为进一步研制ET1重组DNA疫苗奠定基础.1材料和方法1.1材料质粒pGEMGMCSF、真核表达载体pcDNA3.1(+)由第四军医大学石继红教授惠赠;COS7细胞、pGEX4T1载体、菌株

4、DH5a由本室保存；E.乙N.ARplasmidMiniprepKit购自Omega公司；核酸凝胶纯化试剂盒NucleoTrapRGelExtractionKit购自Clontech公司；鼠抗人ET1单抗隆抗体为Oncogene公司产品，人ET1为Sigma公司产品，荧光抗体羊抗鼠IgGFITC购自华美公司;限制性内切酶类，DL2000,T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；丙烯酰胺，NN甲叉双丙烯酰胺，TEMED,SDS及Agrose等购自BioRad公司；Trisbase为Promega公司产晶；小牛血清购自Gibco公司；RPMI1640培养液为Sigma公司产品；

5、低分了量标准蛋口质购自上海丽珠东风生物技术有限公司产品；其余均为国产分析纯试剂.1・2方法1.2.1ET1基因片段的合成委托北京奥科生物技术有限公司合成两端带有BamHI和SalI酶切位点的片段F1GATCCTGCTCCTGCTCTTCCCTGATGGATAAAGAGTGTGTCTACTTCTGCCACCTGGACATCATCTGGAGATCTTGAG(78mer)；F2TCGACTCAAGATCTCCAGATGATGTCCAGGTGGCAGAAGTAGACACACTCTTTATCCATCAGGGAAGAGCAGGAGCAG(78mer).1.2.2合成片段Fl与F2的退

6、火Fl和F2用灭菌双蒸水溶解至100pmol/nL,取适量按常规方法沸煮3min,自然降至室温.1.2.3与克隆载体pGEX4T1的连接pGEX4T1经BamHI和SalI双酶切的回收片段与上述退火产物在T4DNA连接酶作用下进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5（i,铺LB平板37°C孵箱中培养过夜，挑取单菌落扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定及序列分析，得到pGEXET1单体（pGEXET1①）.1.2.4ET1基因的串联取序列止确的质粒pGEXET1①的菌体扩大培养，提取质粒，一份经BamHI和SalI双切回收小片段，另一份经BglII和Sall双切回收大片段，大小片段连接

7、即得ET1二串体（pGEXET1②）；同上酶切回收pGEXET1②的大片段和pGEXET1②的序列分析测定.小片断，连接即可得到ET1④串体（pGEXET1④），并进行酶切及jiff1.2.5GMCSF基因的克隆设计引物Pgf和Pgr,并引入Linker和和应酶切位点：Pgfattagatctggatccggtggttcagcacccgcccgctcgcccag(44mer),Pgrtcctcgagtcactcctggactggctcccag(30mer)・以Pgf,Pgr为弓I物,以木实验室保存的pGEM3zfGMCSF为模