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1、GRA1在COS-7细胞中的表达及鉴定2005,21(1)中国人兽共患病杂志ChineseJournalofZoonoses49文章编号:1002—2694(2005)01—049—03弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究l1.pcDNA3.HBsAg.GRA1在COS.7细胞中的表达及鉴定王丹静,舒衡平,秦志强,蔡力汀,吴翔,蒋立平摘要:目的鉴定pcDNA3一I-IBsAg—GRA1在哺乳动物细胞内是否表达目的蛋白.方法提取pcDNA3一HBsAg-GRA1质粒;体外培养COS-7细胞;pcDNA3一HBsAg—GRA1经脂质体转染体外培养的C
2、OS-7细胞;取转染后的细胞培养上清进行SDS-PAGE.Western-bl0t鉴定.结果成功将pcDNA3一HBsAg—GRA1转染入COS-7细胞.转染的细胞能高效表达分子为47kD分泌性融合蛋白(HBsAg—GRA1).BsAg—GRA1能同时被HBsAb阳性人血清及弓形虫免疫兔血清所识别.结论pcDNA3.I-IB一—GRA1在体外培养的COS-7细胞中高效表达与预期分子量大小相同,且具有免疫学活性的融合蛋白.关键词:pcDNA3一HBsAg—GRA1;表达;COS-7细胞;弓形虫中图分类号:R382.5;R373.2文献标识码:ACoc
3、ktailDNAvaccineagainstToxoplasmagondiiandhepatitisBvirusinfections:ⅡexpressionofpcDNA3-HBsAg—GRA1inmammaliancelllineCOS一7WANGDan-jing,SHUHeng-ping,QINZhi-qiang,CAILi-ting,WUXiang,JIANGLi.ping(DepartmentofPathogenbiology,XiangyaMedicalCollege,CentralSouthUniversity,Changsha4100
4、78,China)ABSTRACT:T0determinewhetherplasmidpcDNA3一HBsAG-GRA1couldexpressthetargetproteininmammalianceUs.plas—midwasextractedandtransfectedintotheculturedCO7celllinevialiposomes.Thesupernatantsfromthetransfectedcellcultureswereanalra~lbySDS-PAGEandWesternblotting.Theresultsshow
5、edthatthepcDNA3一HbsAg—GRA1couldbesuccessfullytran8一fectedintotheCo7cellline,andthetransfectedceUswereabletoexpressandsecreteaHbsAg—GRA1fusionproteinwithanex—pectedmonomersizeof47kDa.Thisfusionproteinwasrecognizedbyboththeanti—rtb~Agandanti—GRA1antibodies,asdemonstrat—edbyELISA
6、orWesternblotting,suggestingthatHbsAg—GRA1isafusionproteinwithimmunologicalactivities.KEYWoRDS:pcDNA3一r-msAg—GRA1;expression;CoS7cellline;ToxoplasmagondiiCOS细胞株源自复制子缺失的猴空泡病毒40(SV40)转化的非洲绿猴肾细胞,COS细胞大量表达SV40T抗原(在SV40复制起点引发DNA复制所必需),pcDNA3含有的SV40复制起点能在COS.7细胞表达的SV40大T抗原的反式激活下启动,D
7、NA以附加体形式在细胞中高拷贝复制,这一T抗原介导的复制可将每一细胞中含有SV40复制起始点的质粒拷贝数扩增至1×105,从而导致转染DNA的高水平表达.但由于转染质粒的复制将毫无节制地不断进行,直至细胞可能由于无法耐受在它的染色体外复制如此大量的DNA而最终死亡,故这一系列的表达是瞬时的.COS-7真核表达系统具有表达效率高,并在转染后48h可获得分泌型蛋白供研究表明,同时对翻译后的蛋白进行加工,更能模拟体内蛋白质的合成.因此COS-7细胞系瞬时表达系统是迅速把克隆化基因在哺乳动物细胞表达付诸实施的最好方法.本研究将真核表达重组质粒pcDNA3.
8、HBsAg—GRA1转染CO7细胞,通过ELISA,SDS-PAGE,免疫印迹等方法,从蛋白水平鉴定pcDNA3.HBsA
