猪氨基肽酶在MDCK细胞中的表达与鉴定

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1、摘要研究发现氨基肽酶(aminopeptidase，APN)是冠状病毒的细胞感染受体，同属于I群冠状病毒的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、人冠状病毒229E、猫冠状病毒等都以相应的氨基肽酶作为其细胞感染的受体。本研究以pMDl8．T-pAPN为模版，设计了一对带有BamHI和Hinal／I酶切位点的引物，将pAPN基因克隆出来并插入到真核表达载体pEFP-C1的BamHI和肼，7皿位点之间，构建了重组质粒pEGFP．C1．pAPN。经公司测序，所插入的pAPN基因连接位点正确，并利用三维蛋白空间结构预

2、测软件预测分析，pAPN基因可以和GFP基因融合表达，所表达出的蛋白的空间结构相互没有影响，与自然存在的蛋白结构相符。选用PEDV非许可性细胞犬。肾细胞(Madin．Darbycaninekidney,MDc目，通过脂质体介导的方法将重组质粒转染至MDCK细胞中，利用载体pEFP-C1含有中新霉素磷酸转移酶抗性基因的特性，向细胞培养液中添加新霉素抗性药物G418筛选，同时运用荧光检测手段，实时检测GFP蛋白的表达情况。经过筛选，筛选出了几株有G418抗性MDCK细胞系，此时，提取该MDCK细胞的总RNA，用

3、OligdT将mRNA进行反转录，针对pAPN基因设计一对检测引物进行RT-PCR反应，检测出了3株转染MDCK细胞有pAPN基因mRNA转录。用PEDV对该3株MDCK细胞系进行感染，有2株产生细胞病变，证明了pAPN在MDCK细胞中表达；同时将该MDCK细胞传10代后，去除选择压力G418药物，并续传至20代后，PEDV感染实验结果还可以产生病变，证明了pAPN在该MDCK细胞中表达稳定。经抗pAPN血清及抗PEDVS蛋白血清中和实验的验证，进一步表明pAPN在PEDV细胞感染过程中起关键作用，推测PE

4、DVS蛋白也参与此过程中，很可能是受体是pAPN，配体是PEDVS蛋白。本实验结果在MDCK细胞上表达了pAPN，经证明PEDV可以在该细胞系上繁殖，从理论上阐明了pAPN最为冠状病毒受体在PEDV感染中的作用，为冠状病毒受体的研究提供了良好的技术平台。关键词：受体表达；猪氨基肽酶；细胞系东北农业大学农学硕士学位论文IVCandidate：YangDiankuiCandidate：Prof．LiⅥjingSpeciality：June，2008研究生学位论文独创声明和使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论

5、文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得——(洼!翅遗直甚丝盖噩挂剔直明的：奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：术易蘑龟垒日期：谛钿日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅

6、和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：者易殿签日期：加近年钼名导师签名：苎，彦日期：纱，年／月膳引言1引言1．1冠状病毒概述冠状病毒粒子为多形态．略呈球形。直径80～160nm，有囊膜及纤突。囊膜突起呈规则的皇冠状排列，又称“日冕病毒”。病毒的基因组为单股正(+)链(ssRNA)RNA，其全长大约有27"-30kb，分子量60万～80万。是目前所有ssRNA病毒中

7、最大的一种，冠状病毒的RNA基因组具有5’帽子和3’的poly(A)结构，与真正的mRNA结构极为相似，具有感染性。病毒基因组在转录时形成一系列以3’端为起点，长度递减的mRNA产物，与动脉炎病毒属相似，同归为套式病毒目(Nidovirales)。冠状病毒基因组编码6种结构蛋冠状病毒属包括了可引起人和动物呼吸道、消化道疾病的一大类重要病原体。I群冠状病毒家家族包括猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)，猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastro

8、enteritisvirus，TGEV)，人冠状病毒229E(Humancomnavirus229E，HCoV-229E)，猫冠状病毒(Felineeoronavirus，FeCoV)，犬冠状病毒(Caninecoronavirus，ccv)及人冠状病毒NL63(HumanCoronavirusNL63，NL)，这组病毒在形态结构特征、基因组结构、复制特征及病毒感染等均具有极其相似的共同特点。PEDV感染猪的肠道