人muc┐1全长cdna基因真核表达载体构建及在cos┐7细胞中的表达

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1、人MUC┐1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS┐7细胞中的表达摘要:目的构建含人MUC-1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS-7细胞中的表达.方法将目的基因MUC-1克隆入pGEM-3zf（-）载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.亚克隆入真核质粒pcDNA3.1（+），构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-MUC-1.用电穿孔法将重组质粒转入COS-7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC-1的表达.结果酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC-1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC-1基因能在COS-7细胞中表达.结论人MUC-

2、1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础.　　KeyanfulllengthMUC1geneandtodetectitsexpressioninCOS-7cells.METHODS　TheMUC1gene-munoflourescenceandFCMidcontainedthecodingregionofhumanfulllengthMUC1gene.TransfectionexperimentverifiedthatMUC1genecouldbeexpressedinCOS-7cells.CONCLUS

3、IONTheeu-karyoticexpressionvectorcontainingtheMUC1geneorphicepithelialmucin），该基因的一个重要特征是其多态性［1-3］（polymorphism），即其第2个外显子中含有可变数量串联重复序列（variablenumberoftandemre-peats，VNTRs），每个VNTR含有60个碱基，富含GC.不同人的VNTRs数量从20～125不等.正常情况下，MUC-1可表达于多种组织、器官中的上皮细胞.但研究［4-7］发现，MUC-1在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤中异常表达，即表

4、达量增高，且整个细胞表面均表达.由于糖基化不全出现新的抗原表位，是一种肿瘤相关抗原;同时，由于MUC-1是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一，肿瘤MUC-1可以非主要组织相容性复合体（MHC）限制性和MHC限制性方式活化杀伤性T淋巴细胞（CTLs），这些活化的CTLs可杀伤表达MUC-1的肿瘤细胞［8］.因此，MUC-1是肿瘤主动特异性免疫治疗理想的靶分子.为研究MUC-1肿瘤核酸疫苗的特异性抗肿瘤作用，我们构建了含人MUC-1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察了该表达载体在COS-7细胞中的表达.　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1菌株、质粒及

5、细胞系E.coliDH5α，pGEM-3zf（-）均由生物技术中心保存，MUC-1质粒（pVax-MUC-1，含32tandemrepeats）和真核表达载体pcDNA3.1（+）由英国ImperialCancerResearchFund的Taylor-Papadimitriou教授惠赠.COS-7细胞由本校生物化学和分子生物学教研室引进.　　1.1.2工具酶及试剂限制性内切酶HindⅢ，SalⅠ，XhoⅠ购自Gibco公司;T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;化学试剂均为国产分析纯.E.Z.N.ARplasmidMiniprepKit购自Omega公司;核酸凝

6、胶纯化试剂盒NucleoTrapRGelExtractionKit购自Clontech公司;DMEM购自Gibco公司;MUC-1mAb为AntibodyDiagnostica公司产品;荧光抗体羊抗鼠IgG-FITC购自华美公司;小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所.　　1.2方法　　1.2.1MUC-1基因克隆将质粒提取、酶切、连接及转化的主要方法均参照文献［9］进行.提取质粒pVax-MUC-1及pGEM-3zf（-）载体，分别经HindⅢ，XhoⅠ及HindⅢ，SalⅠ双酶切（SalⅠ与XholⅠ互补），NucleoTrapRGelExtractionK

7、it回收3.5kbp的MUC-1DNA片段及pGEM-3zf（-），按DNA与载体3∶1比例于16℃连接过夜.取上述连接产物2μL转化感受态细胞DH5α，将转化后的DH5α涂布于含100mg・L-1氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养.16h后挑取单克隆，提取质粒，经HindⅢ，XbaⅠ双酶切鉴定.　　1.2.2DNA序列测定E.Z.N.ARplasmidMiniprepKit小量快速法提取重组质粒pGEM-3zf-MUC-1，用T7promoter引物和SP6引物从正反两向测序.DNA序列测定在博亚公司完成.　　1.2.3真核表达载体的构建重组质粒p

8、GEM-3