人cd44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达

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1、人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达：房新建许文林张徐钱晖陈琛方莉莉陈巧云【摘要】目的：从人类乳腺癌耐多柔比星细胞株细胞（MCF7/Adr)中克隆CD44基因并构建CD44基因真核表达载体pcDNA3.1CD44;将pcNDA3.1CD44稳定转染入人乳腺癌细胞株（MCF7）细胞中。方法：从MCF7/Adr细胞中提取总RNA进行RTPCR，获得全长的cDNA模板；将含有CD44基因的cDNA模板使用限制性内切酶进行双酶切获得带有酶切位点的CD44基因,再将带有酶切位点的CD

2、44基因经TA克隆后测序验证，然后亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1中，双酶切鉴定后再次测序验证。脂质体法将pcDNA3.1CD44质粒转染到MCF7细胞中，48小时后RTPCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF7细胞的表达变化。结果：成功从人MCF7/Adr细胞中克隆获得CD44基因并构建真核表达载体，转染后在MCF7中检测到CD44基因mRNA和蛋白水平表达上调；将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF7细胞经G418筛选两周后获得阳性克隆。结论：成功克隆和建立

3、人CD44基因真核表达质粒；pcDNA3.1CD44能在MCF7细胞中表达；在MCF7/Adr中新发现一种CD44基因的变异体(基因库号FJ216964)；这为进一步研究其基因功能打下了基础。【关键词】CD44；多药耐药；侵袭；乳腺癌［Abstract］Objective:TocloneCD44genefrommultidrugresistanthumanmammarycarcinomacells(MCF7/Adr)andconstructitseukaryoticexpressionvect

4、or.CF7/AdrcellsandclonedintopMD19Tvector.TheCD44genesequenceandreadingframeedbytesandnucleotidessequencing,theninsertedintheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1.TherebinantvectorpcDNA3.1CD44MCF7/Adrcells,anditseukaryoticexpressionvectoridedcontainingt

5、hesequenceofCD44gene.Aftertransienttransfection,themRNAandproteinlevelofCD44genetheabovecells.Conclusion：TheexpressionvectorpcDNA3.1CD44anmammarycarcinomacells.Anesaystartaneethodofgenetherapy.［Keyultidrugresistance；invasion；humanmammarycarcinomacellsC

6、D44分子是一类重要的尚未归类的黏附分子,于1980年由Dalchau等［1］用单克隆抗体技术检测并最初发现,而后经过学者认定属于同一CD44家族。它是一种跨膜糖蛋白并且是透明质酸(HA)的主要受体。CD44分子的主要功能包括作为导向性受体调节淋巴细胞在血液及淋巴液中运行；促进成纤维与淋巴细胞等与细胞外基质成分HA、硫酸软骨素等的黏附。最新研究表明CD44分子的异常表达还可显著提高恶性肿瘤细胞的转移能力,与恶性肿瘤的侵袭、转移及耐药密切相关。Sheridan等［2］认为CD44+/CD24-的乳腺癌细

7、胞亚群表达更高水平侵袭相关基因，因此具有更高的侵袭特性。然而，对于CD44在肿瘤侵袭中所起的作用目前仍存在争论；Lopez等［3］认为CD44在肿瘤细胞中的表达可以阻止肿瘤细胞的转移。因此，为了进一步明确CD44在肿瘤侵袭﹑多药耐药(MDR)及肿瘤生长中所起的作用，本实验拟构建表达CD44基因的真核表达载体，为深入研究CD44基因对恶性肿瘤细胞侵袭及耐药特异性的影响奠定基础。1材料与方法1.1实验材料乳腺癌耐药细胞株(MCF7/Adr)及敏感细胞株(MCF7)购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自

8、杭州四季青公司；RTPCR试剂盒购自Fergma公司；高保真Taq酶、T4连接酶、pMD19T载体、凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；质粒小提、大提试剂盒购自艾思进公司；1640培养基(含10％胎牛血清、0.2%碳酸氢钠)，2.5％含EDTA的胰蛋白酶，Trizol，OptiMEMⅠ低血清培养基(OptiMEM)，Lipofectamine2000转染试剂盒、G418购自Invitrogen公司；限制性内切酶EcoRⅠ，KpnⅠ购自NEB公司