人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体的构建及其在小鼠乳腺癌细胞中的表达

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1、Y977729分类号：Q21UDc：52Z密级：垒珏级⑧西北农林针捉大学2006届攻读硕士学位研究生学位(毕业)论文人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体的构建及其在小鼠乳腺癌细胞中的表达学科专业筮直生物堂研究方向喧乳动麴艇脸王程研究生值尘宝指导教师韭涵麴援完成时间2壁竖生查且人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体的构建及其在小鼠乳腺癌细胞中的表达摘要人溶菌酶(humanlysozyme，hLYZ)参与机体的防御机制，有抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用，因此在医学、食品工业等领域得到十分广泛的应用。天然hLYZ一般是从

2、人乳、中性粒细胞或尿液中少量提取，但由于来源极其困难，提取方法复杂，且安全性得不到保障，不能进行大规模工业化生产。转基因动物乳腺生物反应器具有表达水平高、表达产物活性强、易于纯化和无污染等优点，是大规模生产重组蛋白的新途径。因此，本研究以奶牛B一酪蛋白基因调控区为指导元件，以人溶菌酶(hLYZ)cDNA为表达序列，构建了乳腺特异性表达载体pEBH。转染小鼠乳腺癌细胞EMT6，筛选获得稳定表达株，并对表达产物进行SDS—PAGE分析及Westernblot检测。相关结果如下：1．通过RT-PCR技术成功

3、的从人胎盘组织中扩增出长度为853bp的hLYZ基因cDNA，包含完整的编码序列。经序列分析表明，片段与GenBank中登录的人hLYZeDNA序列的同源性为99％。在读码框内，只有三个碱基发生点突变。但分析表明，这三处突变不影响蛋白质功能。2．利用定向克隆的方法，将hLYZ表达序列与改造好的初级乳腺表达载体pBCP融合在一起，然后定向克隆至真核表达载体pEGFP—C1中，最终构建了含有抗性基因和绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的hLYZ非融合型乳腺特异性表达载体pEBH。3．通过脂质体法将表达载体p

4、EBH转入体外培养的小鼠乳腺癌细胞EMT6，经G418抗性筛选，得到的阳性细胞可稳定地表达绿色荧光蛋白，并且主要在细胞质中表达。通过PCR法检测了报告基因表达的阳性细胞，结果表明hLYZcDNA序列已整合到EMT6细胞染色质中。4．转染细胞增殖后经激素诱导，培养液上清通过SDS—PAGE分析，在约14．7ku处出现了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带。Westemblot检测证明该蛋白是人溶菌酶。关键词：人溶菌酶；乳腺特异性表达载体；转染；小鼠乳腺癌细胞；WestemblotCONSTRUCTION0F

5、MA～口MARYGLAND—SPECIFICEXPRESS10NALVECTORANDEXPRESS10NINMOUSEBREASTCARCINOMACELLSFORHUMANLYSOZYMEABSTRACTHumanlysozyme(hLYZ)participateinthebodydefensemechanism．Itactsasashieldagainstbacterialinfectionandithaseffectsonmalignantgrowthandimmunoloregulation

6、．Soithaswideapplicationinmedicineandfoodstuffindustry．hLYZCanbepurifiedfromhumanbreastmilk，neutrophils，andurine．Becauseofthelimitationofitssourceandthecomplexityofitsextraction，andthepotentialriskoftransmittingpathogenstothenursinginfants，wecannotgetitb

7、ylarge—scale．SodevelopmentofsaferrecombinanthLYZisneeded．Animalmammaryglandbioreactorisanovelalternativestrategyforproductionofrecombinantproteinswithmanyadvantagesincludinghighproductioncapacities，easypurification，faithfultranslationalmodificationsanda

8、uthenticbiologicalactivitiesoftheexpressedproducts．Inthisresearch，themammarygland—specificexpressionvectorpEBHwasconstructed，whichwasconsistedofregulatingelementsregulationregionofbovine3-caseinandexpressionsequencehumanlysozymec