人血清白蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建

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1、西北农林科技大学硕士学位论文人血清白蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建姓名：李虎申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：张涌20050601摘要人血清白蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建人血清白蛋白Humansel-ttmalbumin(HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质，在人体内起着维持血液渗透压、运输、营养等作用。转基因动物乳腺生物反应器是基因制药的新方法，其生产药用蛋白具有安全、高效、成本低廉等优点，因此，通过制备动物乳腺生物反应器生产人血清白蛋白将会呈现美好的前景。本试验以奶牛B．酪蛋白基因(0-casein，CSN2)5’端和37端为

2、调控区序列，人血清白蛋白HSAcDNA为表达序列，构建了含有新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白报告基因的人血清白蛋白乳腺特异性表达载体，为下一步的转染乳腺细胞和将来通过体细胞核移植法制各乳腺生物反应器生产人血清白蛋白打下坚实的基础。相关的研究结果如下：1．根据Genebank(登陆号V00495)中HSA的cDNA序列，设计扩增引物。采用RT-PCR自人肝脏中扩增出HSA基因的1995bp全长cDNA。产物纯化后连至p∞一18T载体，转化大肠杆菌Dlq5tt。筛选阳性克隆菌，酶切鉴定并进行序列分析。结果与GeneBank中登录的人、猴子、牛、猪、绵羊和小鼠的血清白

3、蛋白cDNA序列的同源性分别为∞％、92％、82％、82％、81％和75％，而且，突变并没有引起最大读码框的改变，即成功的克隆了HSA的cDNA序列。2．本试验以肝脏为材料，用Trizol法提取总RNA，经甲醛凝胶变性电泳，能清晰的看到28srRNA和18srRNA以及一条较弱的5srRNA带，表明，所提取的RNA完整性好，完全可以用于RT-PCR反应。3．根据表达载体pEGFP．Cl上的多克隆位点以及质粒pBL中的CSN2启动子序列，重新设计引物，在HSAeDNA两端添加限制性内切酶NheI和BamHI酶切位点，并采用双酶切后定向克隆的方法，成功的将HSA

4、cDNA表达序列与CSN2调控序列融合在～起。测序结果显示，两者正确融合，HSAcDNA读码框正确无误，没有发生影响表达的突变。4．采用双酶切定向克隆的方法，利用真核表达载体pEGFP．C1构建了含有抗性基因、报告基因的人血清白蛋白非融合型乳腺表达载体pEGFP．BH。用PCR方法和酶切方法检测，表明其中的整个人衄清白蛋白乳腺表达构件插入位点准确无误。5．脂质体法将pEGFP—BH转染体外培养的乳腺上皮细胞，经过G418的初步筛选，通过荧光显微镜观察到报告基因绿色荧光蛋白的表达。设计特异性的检测引物，利用PCR法检测了报告基因表达的阳性细胞，结果显示构建载体

5、的合理性而且表达构件已经初步人血清白蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建整合到阳性乳腺细胞的染色体中。关键词：人血清白蛋白，cDNA,真核表达载体，细胞表达一垒呈!!垦垒兰!一———坐，-。__。__-_。_。_。’。_—●_。-。_。_。。_。___。_。__‘。。。。_。●●_-_-‘_。_。。-。。_。。’’。。。—。—’’_。。’—’。。。’——1一CLONINGANDCONSTRUCTIONOFMAMMARYGLANDEXPRESSIONVECTOROFHUMANSERUMALBUMINGENEABSTRACTHuman$erornalbumi

6、n(HSA)isthemostabundantproteininhuamanbtoodplasma．HSAtakesanimportantroleinhumanbodies．Thenewmethodofproducinggene-medicineisthrougllmakingmammaryglandbioreactorproducingmedicalproteinwiththesafe，effectiveandlowcostprospectstartingpoint．Thatistosayitispromising．Inthisresearch，thema

7、mmarygland·specificexpressionvectorofhumanserunlalbuminwasconstrcted，whichwaspartialconsistedoftheconductingelementsincludingthe57and3"regulationregionofbovinet-casein，theexpressionsequenceofHSAeDNA，antibioticsgene(Kana／Neo)andreportgene(EGFP)．soitcanbeusedtotrans-feetmammaryepithe

8、lialcells．Positiveclonecel