内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的表达鉴定

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1、内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的表达鉴定编辑。【摘要】目的：克隆、表达内皮素l(endothlinl,ETl)串联体,提高ET1的免疫原性及其免疫机体后产生抗体的效价•方法：通过pGEX4T1载体对ET1的基因进行了串联，并在ET1串联基因下游引入GMCSF基因，酶切鉴定及序列分析构建重组质粒；再将含有ET1串体与GMCSF的融合基因连接至真核表达载体中，同样经过酶切鉴定及序列测定证实；并对构建表达载体转染COS7细胞，应用间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因在COS7细胞中的表达情况.结果：正确构建

2、了ET1重复序列4串体基因与GMCSF基因重组的克隆载体pGEXET1④GMCSF以及真核共表达质粒ET1④GMCSF；间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因ET1和GMCSF在COS7细胞中都得到了表达.结论：内皮素1串联体的构建及其在COS7细胞中的成功表达将对ET1的免疫学特性、核酸疫苗的研制以及相关自身疾病免疫治疗的进一步研究奠定基础.【关键词】内皮素1COS7细胞自体免疫0引言内皮素1是1988年由Yanagisawa等［1-2］从培养的猪主动脉内皮细胞上清液中分离纯化出的一种小分子血管收缩肽，广泛分布

3、于神经系统、循环系统和内分泌系统等，具有广泛的生物学活性，作为强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原参与心肌缺血、高血压脑卒中以及肾衰等许多疾病的发病过程[3]•本文将ET1基因串联构建ET1④串体并与GMCSF基因融合，构建pcDNAET1GMCSF真核表达载体，并对重组质粒在COS7细胞中的表达进行了鉴定，旨在增加ET1的免疫原性，制备高滴度的ET1抗体；为进一步研制ET1重组DNA疫苗奠定基础.1材料和方法材料质粒pGEMGMCSF、真核表达载体(+)由第四军医大学石继红教授惠赠；COS7细胞、pGEX4T1

4、载体、菌株DH5a由本室保存；E.Z.N.ARplasmidMiniprepKit购自Omega公司；核酸凝胶纯化试剂盒NucleoTrapRGelExtractionKit购自Clontech公司；鼠抗人ET1单抗隆抗体为Oncogene公司产品，人ET1为Sigma公司产品，荧光抗体羊抗鼠IgGFITC购自华美公司；限制性内切酶类，DL2000,T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；丙烯酰胺，NN甲叉双丙烯酰胺，TEMED,SDS及Agrose等购自BioRad公司；Trisbase为Promega公司产品；小牛

5、血清购自Gibco公司；RPMI1640培养液为Sigma公司产品；低分子量标准蛋白质购自上海丽珠东风生物技术有限公司产品；其余均为国产分析纯试剂.方法基因片段的合成委托北京奥科生物技术有限公司合成两端带有BamHI和SalI酶切位点的片段F1GATCCTGCTCCTGCTCTTCCCTGATGGATAAAGAGTGTGTCTACTTCTGCCACCTGGACATCATCTGGAGATCTTGAG(78mer)；F2TCGACTCAAGATCTCCAGATGATGTCCAGGTGGCAGAAGTAGACACACTCT

6、TTATCCATCAGGGAAGAGCAGGAGCAG(78mer).合成片段F1与F2的退火F1和F2用灭菌双蒸水溶解至1OOpmol/UL,取适量按常规方法沸煮3min,自然降至室温.与克隆载体pGEX4T1的连接pGEX4T1经BamHI和SalI双酶切的回收片段与上述退火产物在T4DNA连接酶作用下进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5a,铺LB平板37工孵箱中培养过夜，挑取单菌落扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定及序列分析，得到pGEXET1单体.基因的串联取序列正确的质粒pGEXET1①的菌体扩大培养，提取质粒，

7、一份经BamHI和Sall双切回收小片段，另一份经BgIII和Sall双切回收大片段，大小片段连接即得ET1二串体；同上酶切回收pGEXET1②的大片段和pGEXET1②的小片断，连接即可得到ET1④串体，并进行酶切及序列分析测定.CSF基因的克隆设计引物Pgf和Pgr,并引入Linker和相应酶切位点：Pgfattagatctggatccggtggttcagcacccgcccgctc£cccag(44mer),Pgrtcctcgagtcactcctggactggctcccag(30mer).以Pgf,Pgr为引物，

8、以本实验室保存的pGEM3zfGMCSF为模板进行PCR扩增，回收产物进行序列分析•测序正确的PCR产物经BglII和Xhol双酶切后回收.构建重组克隆及表达质粒回收经Bglll和Xhol双酶切的GMCSF产物及测序正确的用同样双酶切的pGEXET1④载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,铺板培养，挑取单菌落扩大培养，提取质粒进行酶切鉴