毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌定量研究论文

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1、毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌定量研究论文王朔王惠民，褚少朋，汪桂华【摘要】目的：定量研究毛细管区带电泳法（CZE）分离大肠埃希菌（E.coli）以满足临床诊断要求。方法：用毛细管区带电泳法对E.coliATCC25922进行分离，研究其峰高与E.coli量的关系。结果：毛细管区带电泳法分离E.coliATCC25922浓度在105cfu/ml～5×107cfu/ml之间线性很好，其峰高与浓度关系符合线性方程：㏑mAU＝﹣5.256＋1.0036×㏑C,R2＝1。结论：CZE法分离大肠埃希菌可进行定量研究。【关键词】毛细管区带电泳

2、；分离；大肠埃希菌AbstractObjective:AquantitativestudyaboutdeterminationofEscherichiacoli（E.coli）bycapillaryzoneelectrophoresis（CZE）eettheclinicdiagnosisrequest.Methods:DQ毛细管电泳仪和UV检测器,河北永年锐沣色谱器件公司未涂层石英硅毛细管（内径75μm），上海天达pHS-3TCpH计（0.01级）。1.2试剂和菌株来源聚氧化乙烯（PEO）、Tris和EDTA(Sigma-Aldr

3、ich公司)，硼酸、氢氧化钠、盐酸（上海化剂厂分析纯级），实验用水为双蒸馏水。采用上述材料配制TBE贮存缓冲液（4.5mmol/LTRIS-4.5mmol/L硼酸-0.1mmol/LEDTA，pH8.6），将其1∶16稀释，添加终浓度为0.0125%的PEO(Mn600000)，并用0.1mmol/LNaOH和盐酸调整pH至9.0，作为电泳缓冲液待用。E.coliATCC25922（卫生部临床检验中心）。1.3方法1.3.1电泳方法采用内径75μm、有效长度（进样端至检测窗口）为40cm的石英毛细管，阳极0.5psi压力进样20s

4、，电压25kV，电泳时间15min，25℃恒温，阴极检测，波长214nm。开机后及每一份标本检测前依次用1.0mol/L氢氧化钠、双蒸馏水、电泳缓冲液20psi冲洗毛细管5min。1.3.2检测方法将血琼脂平板上经35℃，18~24h培养的E.coliATCC25922的菌落挑于电泳缓冲液中，配成5×107、107、106、5×105和105cfu/ml，静置30min后进行毛细管区带电泳。1.4统计学方法使用SPSS11.5forl的大肠埃希菌,谱峰高度分别为316、61、6.2、2.84和0.62mAU（毫吸光度），峰形尖锐，

5、分离效率高。电泳图谱见图1。2.2CZE分离E.coli峰高与浓度的线性关系根据5次定量试验结果，对大肠埃希菌浓度（C）和相应检测的峰高（mAU）分别取对数，以㏑C为横坐标，㏑mAU为纵坐标，作回归曲线，线性方程为：㏑mAU＝-5.256＋1.0036×㏑C,R2＝1。3讨论细菌为胶体颗粒，比表面积极大，且覆盖着多糖类、肽聚糖、脂类等物质，这些化合物在电泳缓冲液中可因解离和吸附形成双电层；因而，毛细管区带电泳将细菌当作“离子”看待，以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，在电渗流作用下达到高效聚焦和分离3，4。毛细管区带电泳法

6、已成功分离了多种细菌，并取得非常高的分离峰效应（高达10-9表观理论塔板/m）5。我们发现大肠埃希菌ATCC25922通常保持较高的存活率，极易聚集出现杂峰，影响分离度。消除聚集可在电泳前使大肠埃希菌与运行缓冲液充分混匀后静置30min以利于缓冲液和添加剂充分与大肠埃希菌作用，形成相对稳定的单个离子减小聚集。本研究显示毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌浓度在105～5×107cfu/ml时定量实验敏感性好、分离效率高，峰高与大肠埃希菌浓度的线性关系较好，可依据峰高用回归方程分析大肠埃希菌浓度,回归方程：㏑mAU＝-5.256＋1.00

7、36×㏑C,R2＝1；对于菌量105cfu/ml，本试验可将菌液进行10倍浓缩，提高浓度后检测。随着毛细管区带电泳技术自动化操作的实现，利用其快速、高效、重复性好等优点，为临床快速、批量分离和分析微生物提供了一个很好的选择性手段6。尽管毛细管区带电泳法分析微生物还存在着一些亟待解决的问题7，但本研究显示经过实验条件的优化，其在微生物的分离和分析中可以得到很好的结果；毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌，操作简便、快速、灵敏度高、溶剂消耗少、环境污染小，具有较高的研究价值和前景。【