木犀草素的体外抗炎机制研究论文

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1、木犀草素的体外抗炎机制研究论文【摘要】【目的】观察木犀草素对脂多糖(LPS)诱导的RASA)检测NFκB的DNA结合活性；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定RASA),mRNAexpressionofCOX2inedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR),andNFκBandCOX2proteinexpressioninRAMATION/TCDtherapy;SIGNALTRANSDUCTION；GENEEXPRESSIONREGULATION；CELLCULTURE木犀草素(Luteolin

2、)属于黄酮类化合物.freelan公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二甲基亚砜（DMSO）、焦碳酸乙二酯（DEPC）等为Sigma公司产品；RPMI1640为Gibco公司产品；超级小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；总RNA提取试剂（Trizol）为Invitrogen公司产品；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）一步法试剂盒为宝生物（大连）工程有限公司产品；100?bp?DNA?marker、N,N,N,N四甲基乙二胺（TEMED）、6倍上样缓冲液均为华美生物工程公司产品；增强化学发光（ECL）试剂、抑酞酶（Aprotinin）均购于上海华舜生物工程有限公司；β

3、actin山羊IgG多克隆抗体、NFκB小鼠IgG单克隆抗体和COX2山羊IgG多克隆抗体均为北京中山公司产品；聚偏(二)氟乙烯（PVDF）膜为美国PallGelman公司产品；NFκB寡核苷酸链为上海生物工程公司产品；γ32P标记三磷酸腺苷（［γ32P］ATP）为北京亚辉生物工程公司产品；T4噬菌体多核苷酸激酶为Promega公司产品。12方法121细胞培养RAI1640培养液传代培养。122PGE2含量测定将对数生长期的RASA)细胞培养及分组同122。细胞核蛋白的提取：细胞以冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次后加入100?μL缓冲液A［10

4、?mmol/L?N2羟基哌嗪N2乙磺酸（HEPES）-KOH、15?mmol/L?MgCl2、10?mmol/L?KCl、1?mmol/L?苯甲基磺酰氟（PMSF）、10?mg/L?Leupeptin、35?mg/L抑酞酶（Aprotinin）、1?mmol/L二硫苏糖醇（DTT）］，冰上放置15?min，再加体积分数为10%壬基酚聚氧乙烯醚（NP40）10?μL，振荡混匀；然后10?000?g、4?℃、离心10?min；于沉淀中加100?μL缓冲液B［20?mmol/L?HEPESKOH、27?mol/L?甘油（Glycerol）、420?mmol/

5、LNaCl、15?mmol/L?MgCl2、1?mmol/L?PMSF、1?mg/L?Leupeptin、10?mg/L?Aprotinin、1?mmol/L?DTT］，冰浴30?min，离心取上清液，考马斯亮蓝法测定核蛋白浓度后，－70?℃保存。广州中医药大学学报2007年第24卷第3期张毅，等.木犀草素的体外抗炎机制研究双链寡核苷酸探针的标记：含有NFκB特异性识别位点的双链脱氧寡核苷酸序列如下:5AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3；3TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5。依次加入寡核苷酸探针(10?pmol/μL)10?μ

6、L、10倍T4多核苷酸激酶缓冲液2?μL、T4多核苷酸激酶(10?U/μL)10?μL、［γ32P］-ATP(10?μCi/μL)25?μL、无核酸酶水135?μL，共20?μL。反应混合液于37℃孵育10?min，加入05?mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)1?μL终止反应。乙醇沉淀法去除未结合标记物。取10?μg核蛋白与放射性核素标记的DNA探针在室温进行结合反应30?min，总体积为10?μL。DNA蛋白复合物经40?g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压110?V，电泳60?min。真空负压加热干燥凝胶后，－70?℃放射自显影，显影后扫描至计算机。用

7、Bandscan43图像分析软件进行光密度积分值分析。每个图像均重复分析3次，取平均值。124RTPCR测RAAPK信号传导M.DNA分子量标准；图2木犀草素对RA,.freelPharmacol,2001,62(1):111.［2］HuC,KittsDD.Antioxidant,prooxidantandcytotoxicactivitiesofsolventfractionateddandelionflo,2003,52(2):301.［3］XagorariA,PapapetropoulosA,Mauromatis