木犀草素体内抗炎作用机制研究

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1、木犀草素体内抗炎作用机制研究:张毅,王旭光,杨展,何惠娟【摘要】目的探讨木犀草素(Lut)的体内抗炎疗效及作用机制。方法采用角叉菜胶致大鼠足爪肿胀模型,观察Lut对足爪肿胀度的影响;酶免疫测定法(EIA)测定炎足足跖部的渗出液前列腺素E2(PGE2)的含量;免疫组织化学法(IHC)及免疫印迹(ethodsThemodelofcarrageenaninducededemaofrathindpaamodelethasone(forapositivecontrol).ThePGE2contentintheedemaexudateeasuredbyEIA.The

2、COX2expressionoftheedemapamunohistochemistryandapamatoryeffectonratinflammationinducedbycarrageenanprobablythroughthemechanismsoftheinhibitionofCOX2proteinexpressionandofPGE2production.  Keymation;prostaglandinE2  木犀草素(Luteolin,Lut)属于黄酮类化合物,主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物,近年研究表明Lut具有抗氧化、抗肿

3、瘤、抗炎、免疫调节等作用[12]。我们研究发现Lut在体外能抑制环氧合酶2(COX2)mRNA及蛋白表达,同时降低NFκB的DNA结合活性和蛋白表达[3],其抗炎机制可能与此有关。为进一步探讨Lut的抗炎作用机制,我们建立大鼠足爪肿胀炎症模型,研究Lut对炎症大鼠COX2表达及前列腺素E2(PGE2)生成的影响。1材料和方法1.1材料清洁级雄性SD大鼠,体质量150~250g,由广东医学院实验动物中心提供。角叉菜胶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等为美国Sigma公司产品;Lut(纯度>98%)和PGE2EIAKit为美国Cayman公司产品;β

4、actin山羊IgG多克隆抗体、COX2山羊IgG多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒均为北京中山公司产品;PVDF膜为美国PallGelman公司产品。1.2方法  1.2.1大鼠分组  50只大鼠随机分为5组,分别为空白对照组、2mg/kg地塞米松(Dex)阳性对照组及40、80、120mg/kgLut3个剂量组,每组10只。实验时分别腹腔注射等体积生理盐水、地塞米松及40、80、160mg/kg剂量的Lut。  1.2.2大鼠足爪肿胀测定  腹腔注射给药30min后于大鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1mL/只致炎,分别在致炎前,致炎后0.5、1、

5、2、3、4、5h用大鼠足爪容积测定仪测量炎足爪容积,计算各组大鼠不同时间点足爪肿胀度。肿胀度(mL)=致炎后右后足容积-致炎前右后足容积。  1.2.3大鼠足爪炎性渗出物中PGE2含量的测定  大鼠右后足致炎5h后处死大鼠,于大鼠右踝关节处剪下足爪,称重剥皮浸泡于5mL生理盐水中浸泡30min,取出足爪,离心浸泡液15min(3000×g),取上清液0.5mL,以PGE2EIAKit测定其中的PGE2含量(μg/g),并计算抑制率。  抑制率IR(%)=对照组PGE2含量-给药组PGE2含量对照组PGE2含量×100%  1.2.3g加入0.2mL细胞裂解

6、液在匀浆器中匀浆后,将裂解液于冰上超声破碎细胞(10s/次×3次,间隔15s),4℃,12000g离心10min,收集上清液,考马斯亮蓝(G250)染色法测上清液蛋白质含量。每组各取50μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后,进行10%SDSPAGE;电转移至PVDF膜;用含5%脱脂奶粉的TBS(PH8.0)封闭2h;分别加入适量COX2和βactin多克隆抗体,摇床上室温反应2h;洗膜3次每次20min;加辣根过氧化物酶标记的二抗,室温反应2h;洗膜后作ECL化学发光,X片曝光显影。图像经扫描仪扫描后,用图像分析软件BandScan5.0进行光密度积分

7、值分析,计算目的蛋白与内参照βactin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。  1.2.4免疫组织化学(IHC)  取足跖部位的组织,用10%中性缓冲福尔马林及时固定,石蜡包埋,切片,贴片,常规脱蜡。0.1mol/LPBS(pH7.4)浸泡5min。微波修复抗原。滴加正常山羊血清封闭液(试剂B),室温20min。滴加1:50稀释的COX2羊IgG单克隆抗体,阴性对照以PBS代替一抗,于4℃孵育过夜。PBS洗3次。滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液(试剂C),室温孵育10min,PBS冲洗3次。滴加试剂SABC(试剂D),37℃,

8、30min,PBS冲洗3次。DAB显色。苏木素轻度复染。脱水,透明

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