hbv感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定论文

《hbv感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定论文【摘要】目的：建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库，并从中克隆鉴定出新的应答基因.方法：分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA，用SMARTPCR技术合成全长双链cDNA，经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组，分别衔接两个不同的接头，再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR，将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增.freelega公司，SMARTPCRcDNA

2、合成试剂盒、PCRSelectcDNA消减杂交试剂盒、Advantage2cDNAPCR试剂盒、PCRSelectDifferentialScreening试剂盒、NucleoTrapPCR纯化试剂盒及尼龙膜、单面乳胶胶片均购自Clontech公司，［α32P］dATP购自北京福瑞生物工程公司核酸研究室.1.2方法1.2.1HBV感染培养人胎肝细胞［1-2］用纤维连接素包被培养皿，将冻存的22g/L.以感染细胞为检测方，以未感染细胞为驱动方，加T4DNA连接酶1μL（6.66μkat），分别与接头

3、1和2连接，16h反应过夜后进行接头连接效率检测.在鉴定连接效率满意（25%）后，将连接有接头1和2的检测方dscDNA1.5μL分别与1.5μL驱动方dscDNA在68℃下杂交8h后，立即将经过第一次消减杂交的两组体系混合，另加新变性的驱动方cDNA1μL，68℃杂交12h，稀释（1∶200）.取1μL稀释后的第二次杂交后产物做模板，在50×advantageTaq聚合酶作用下，以接头1和2的外侧序列分别为5′及3′引物，进行第1次PCR扩增；取第一次PCR产物3μL，10倍稀释后取1μL做模板，以接

4、头1和2内侧序列分别为5′及3′的巢式PCR引物，进行第二次PCR扩增，并进行PCR产物消减效率检测.1.2.3cDNA消减文库的构建及PCR鉴定克隆取3μLPCR产物及2μL线性化质粒载体，在1μLT4DNA连接酶的作用下，14℃反应12h后，-20℃保存.取2μL连接反应产物转染200μL感受态大肠杆菌，225r/min摇菌1.5h，取200μL菌液种植于含氨苄青霉素的LB/Xgal/IPTG培养板上，37℃培育18h.计数培养板中直径1mm清晰的白色及蓝色菌落数.随机挑取128个白色菌落于含氨苄青

5、霉素的LB培养基中37℃摇菌过夜，取菌液1μL做模板，以接头1和2内侧序列分别为5′及3′的PCR引物，进行PCR扩增，选取含有明确单一目的片断的克隆99个进行杂交筛选.1.2.4斑点杂交法进行差异筛选取鉴定过的含有单一明确目的片断克隆的PCR反应液5μL加5μL0.6mol/LNaOH，混匀变性；取2μL新鲜变性cDNA，分别点样于尼龙膜上；0.5mol/LTrisCl（pH7.6）中和，杂交炉中70℃烤膜2h固定.预杂交1h后加入32P标记的4种探针：正向消减探针、检测相未消减探针、反向消减探针、

6、驱动相未消减探针进行杂交过夜，加入探针的cpm值为107.洗膜后进行放射自显影，选取差异表达的克隆.用Ｍ（-20）引物测序，由北京鼎国公司代理.2结果2.1总RNA的定性定量分析紫外分光光度计检测检测相和驱动相胎肝细胞总RNA量分别为500和150g/L，A260/2801.8，10g/L琼脂糖凝胶电泳见RNA的28S和18S亚单位十分清晰，二者比例约为1.5∶1，证实RNA质优量足.2.2SMARTPCR合成长距离dscDNA在10g/L琼脂糖凝胶电泳上见dscDNA为0.5～8.0kb的弥漫性条带.

7、2.3RsaI酶切可见dscDNA由0.5～8.0kb的弥漫性条带降解为约0.2～2.0kb的条带（图1），证实酶切十分成功.图1DscDNA样品经RsaI消化前后20g/L琼脂糖凝胶电泳2.4DscDNA两端接头连接效率检测将连接有接头1和2的两组胎肝细胞dscDNA分别用G3PDH3′,5′引物及以G3PDH3′引物和接头上5′引物进行PCR扩增.结果显示两组胎肝细胞接头连接效率均50%,即50%以上dscDNA已与接头连接.2.5两次抑制性PCR后的电泳两次抑制性PCR后分别取8μL扩增产物在15

8、g/L琼脂糖凝胶电泳上可见正向和反向消减后的产物为约100～600bp的弥漫性条带,而未消减前的产物为较大分子质量的弥漫性条带（图2）.图2第2次PCR产物琼脂糖凝胶电泳2.6cDNA消减文库消减效率鉴定消减后PCR产物中G3PDH在28个循环后可见弱的条带,而消减前G3PDH在18个循环后即可见明显条带（图3），说明所构建的消减文库具有很高的消减效率.18,23,28,32:PCR循环数.图3扩增看家基因G3PDH检测消减效率凝胶电泳2.