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1、原代培养人胎肝细胞体外感染HBV的研究世界华人消化杂志2000年第4期第8卷研究原著作者：蒋业贵李奇芬毛青王宇明单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院全军传染病中心重庆市400038关键词：乙型肝炎病毒；感染；人胎肝细胞；细胞培养摘要：目的建立HBV感染人胎肝细胞体外培养系统。方法首先分离、培养人胎肝细胞，然后应用HBV阳性血清感染体外培养的人胎肝细胞；每隔2d收集上清液和肝细胞，应用ELISA,免疫组化法、原位杂交法和斑点杂交法检测上清液和细胞中HBsAg和HBVdNAo结果上清液中HBsAg在感染后2d〜20d均可测出，以
2、感染后4d〜16d达高峰（A值在0.22左右）。免疫组化检测细胞屮HBsAg呈阳性表达，原位杂交和斑点杂交检测细胞和上清液屮HBVdNA也呈阳性表达。结论HBV在原代培养人胎肝细胞屮能稳定复制和表达至少达16d0PrimaryhumanfetalhepatocyteswithHBVinfectioninvitroYeGuiJiang,OiFenLi,OingMao,YuMingWang（CentreofInfectiousDisaases,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalunivers
3、ity,Chongqing400038,China)Abstract:AIMtoestablishaculturesystmnofHBV-infectedlaznanfetalhepatocyteinvitro.METHODSHumanfetalhepatocyteswereisolatedandcultured,theninfectedwithHBVpositiveseruminvitro.Supematantandcellswerecollectedevery2days・HbsAgandHBVDNAweredetectedb
4、yELISA,immunohist-ochemistry,insituybridizationanddotblothybridizationincellsandsupernatant・RESULTSHBsAgcouldbedetectedfromday2today20afterHBV-infectioninsupernatantandhepatocytes・SecretionofHBsAgreachedsubmitfromday4to16afterhBV-infectioninsupematant(Avalue:abcut0.2
5、2)・HBsAgcouldbedetactedbyimmunohemistryincells・HBVDNAcouldbedetectedbyinsituhybridizationanddotblothybridizationincellsandsupernatont.CONCLUSIONPrimaryhumanfetalhepatocytesarecumpetontforinfectionwithHBV.HBVcanstablyreplicateandexpressInHBV-infectedhumanfetalhepatocy
6、tes,andatleastthisreplicationandexpressioncanlast16days・Keywords：hepatitisbvirus;HBVinfection;humanfetalhepatocyte;cellculture0引言日前，有关HBV的研究，主要是利用HBV基因转染细胞株，但这些细胞株不能完全模拟人体肝细胞的生物学功能，用于研究HBV时，不能完全代表体内情况。用人胎肝细胞作为感染对象，建立HBV感染人胎肝细胞培养系统，可解决上述不足，我们应用HBV感染人胎肝细胞，初步建立了HBV感染人胎肝
7、细胞体外培养系统。1材料和方法1.1材料人工流产22周龄儿肝脏，经体外两步灌流法分离肝细胞，台盼蓝染色人胎肝细胞成活率达90%以上.HBV感染血清取自本科一慢性乙型肝炎患者，ELISA检测HBsAg(+),HBeAg(+),抗一HBc(+),血清斑点杂交HBVDNA(+),甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒标志均为阴性。1.2方法采用王宇明etal[l]设计的体外两步灌注法首先分离出总肝脏细胞悬液，再以差速离心方法分离、纯化肝细胞。将分离的人胎肝细胞用含lOOmL/L小牛血清(FBS)的RPMI1640培养液调整细胞密度为4X108/
8、L,接种于24孔塑料培养板内.每孔含培养液0.5mL(即每孔含细胞数为2x105个)，每24h更换培养液.培养48h后，于培养液中加入HBV感染血清(终体积分数为10%),并在培养液中加入40g/L聚乙二醇(PEG).37°C培养16h(过夜)后，弃去上清液，细
