hbv感染胎盘滋养细胞的体外研究

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1、HBV感染胎盘滋养细胞的体外研究作者：陈天艳，陈云茹，刘敏，牛迎花，蔺淑梅，叶峰，张曦，刘锦锋，赵英仁，张树林【摘要】　　目的：对早孕绒毛的滋养细胞进行原代培养，利用HBV感染血清对滋养细胞进行体外感染，探讨细胞在体外培养条件下对HBV的感染率及HBV在细胞中的复制状态.方法：利用胰蛋白酶和胶原酶联合消化培养法原代培养早孕胎盘中的滋养细胞，并进行免疫组化鉴定，获得纯度较高的滋养细胞后进行体外的HBV感染，通过细胞免疫化学染色、ELISA及PCR法分别检测细胞上清中的HBsAg，细胞中的HBVDNA及cccDNA.结果：原代培养的滋养细胞，细胞生长良好，特异性角蛋白7阳性，纯度高.原

2、代滋养细胞在与HBV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变，感染后24h和48h在滋养层细胞细胞浆中可见HBsAg的阳性表达，被感染细胞呈散在分布.感染后48h起可检测到弱阳性的HBsAg及HBVDNA，感染后细胞内未检测出cccDNA.结论：利用联合酶消化法建立了胎盘中滋养细胞的体外培养系统.HBV能够在体外感染原代培养的滋养细胞，对被感染细胞的生长无明显影响.HBV可能不在滋养细胞中复制.【关键词】乙型肝炎病毒；滋养层细胞；原代细胞培养【Abstract】AIM:Tosetuptheprimaryculturemodeloftrophoblasticcellsfromhuman

3、placentaandtoinvestigatetheinfectionratioandreplicationoftrophoblasticcellscocultured.METHODS:Usingtrypsinandcollagenaseassociateddigestion,trophoblasticcellshumanplacenta.Immunohistochemistrystainingofthecellsaryculturecellsbyspecificanticytokeratin7.Trophoblastcellsfor24h.Theinfectioneffici

4、encyinedbyELISAofculturesupernatants,immunohistochemistryofcellslidesandPCRamplificationforHBVDNAandcccDNAofinfectedcells.RESULTS:TheprimaryculturemodeloftrophoblasticcellsfromhumanplacentaorphologyoftrophoblasticcellsshoediumembraneandcytoplasmiclocalizationofHBsAgepointsdidnotshoaryculturemod

5、eloftrophoblastcells.OurstudyindicatesthattrophoblasticcellsculturedinvitrocanbeinfectedbyHBV.Buttheefficacyofinfectionisloaryculture　　0引言　　HBV母婴垂直传播可发生于宫内、产程和产后［1］.随着我国将乙肝疫苗纳入计划免疫，宫内感染逐渐成为乙肝免疫失败的重要原因，阻断宫内感染将是控制我国乙肝流行和预防HBV相关疾病的关键.胎盘被认为是宫内感染最主要的途径［2］.胎盘是母体与胎儿之间的物质交换的桥梁，在HBV母婴传播中，它不仅是一个物理屏障，也构成了

6、HBV宫内感染胎儿的通道.由于胎盘屏障的第一层细胞是滋养层细胞，该层细胞直接与母亲血液接触，因此，HBV宫内感染的实现必须建立在HBV成功跨越胎盘屏障滋养层细胞的基础上.既往研究［3］显示HBV可感染胎盘组织中的各类细胞，但大多是临床病理结果，体外研究很少.建立在滋养层细胞来源的肿瘤细胞系中的研究固然方便，但在其实验结果的解释上及其适用性方面逊于原代培养细胞.本研究利用消化法培养原代胎盘滋养层细胞，建立胎盘细胞的体外培养系统.利用HBV感染血清进行体外感染，探讨体外培养条件下对HBV的感染率及病毒在细胞中的复制状况，为进一步的研究奠定基础，为控制HBV宫内胎盘感染提供新的线索.1材料

7、和方法1.1材料DMEM（高糖型）培养基（含有HEPES和L谷氨酰胺）和胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶和胶原酶I（美国Sigma公司）；抗角蛋白7IgG，波形蛋白IgG，鼠抗人HBsAgmAb，HBVMELISA试剂盒，羊抗小鼠链霉亲和素过氧化物酶免疫组化试剂盒(北京中杉科技有限公司)；青、链霉素（宝生物大连有限公司）.HBVDNA及cccDNAPCR引物由上海生物工程公司合成，6~10ol/LPBS液（含青霉素500U/mL，链霉素5