hbx蛋白通过调控原代小鼠肝细胞周期促进hbv复制的分子机制研究

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1、重庆医科大学博士学位论文HBx蛋白通过调控原代小鼠肝细胞周期促进HBV复制的分子机制研究姓名：罗娜申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：吴小翎201205重庆医科大学博士研究生学位论文I-t-Bx蛋白通过调控原代小鼠肝细胞周期促进HBV复制的分子机制研究摘要背景和目的：乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，I-IBV)编码的HBx蛋白是一种多功能调节蛋白，它与HBV复制水平和HBV相关性原发性肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的发生和发展密切相关，但其具体调控机制尚未完全阐明。目前研究发现在永生化和转

2、化细胞系中，有效的HBV复制依赖于HBx蛋白，其中HBx蛋白的羧基端具有关键作用。但在正常肝细胞中，HBx通过何种途径调控HBV的复制、如何影响细胞增殖途径以及其作用的确切功能区尚不清楚。本课题以正常原代培养小鼠肝细胞为研究对象，探讨HBx蛋白及其截短体对细胞周期和HBV复制水平的影响及其相互关系，并确认HBx发挥上述作用的主要功能区，以揭示HBx蛋白参与调控细胞周期和HBV复制的分子机制。方法：(1)运用改良的原位两步胶原酶灌流法对C57BL／6小鼠肝细胞进行分离纯化，采用含多种添加物的无血清WME培养基对小鼠肝细胞进行原代培养，过碘酸雪夫氏

3、(Periodicacid．Schiff's，PAS)染色、生化法鉴定肝细胞的功能和分化特性，免疫蛋白印迹(Westemblot)法本课题受国家自然科学基金(项目批准号：30872249)和重庆市卫生局医学科研计划项目重点项目(项目批准号：2010-1-37)资助。3重庆医科大学博士研究生学位论文检测新鲜分离和原代培养肝细胞的细胞周期标志物p16、p21、cyclinD1、cyclinE、cyclinA的表达水平。(2)利用船x及其截短体表达质粒pSI．HA．X、pSI．HA．X卜101、pSI．HA．X43。154，瞬时转染原代培养小鼠肝细胞

4、，免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)／Westernblot法检测HBx蛋白表达水平。Westemblot法检测细胞上述周期标志物表达水平。(3)利用编码HBV全基因组1．2倍体(paywl．2)的pGEM-HBV质粒和HBx缺失突变的相同质粒pGEM-HBVAX瞬时转染原代培养小鼠肝细胞，将pSI．HA．X、pSI．HA．X1砌1、pSI．HA．炙3。154分别与pGEM-HBVAX共转染细胞，IP／Westernblot法检测HBx蛋白表达水平，Westernblot法检测细胞上述周期标志物及HBV编码蛋白HBc的表达

5、，Southem印迹杂交(Southernblot)及实时荧光定量PCR检测HBV复制水平。(4)利用特异性沉默p53基因的miRNA干扰质粒分别与pGEM-HBV和pGEM-HBVAX共转染原代培养小鼠肝细胞，IP／Westernblot法鉴定p53沉默效率，Westernblot法检测细胞上述周期标志物及HBV编码的HBc蛋白的表达，Southem印迹杂交(Southemblot)和实时荧光定量PCR法检测HBV复制水平。结果：(1)原代培养的小鼠肝细胞能保持合成白蛋白、尿素、糖原的肝脏特异性功能和分化特性，并能维持与新鲜分离肝细胞相同的静

6、息细胞周期(GO期)状态。4重庆医科大学博士研究生学位论文(2)在转染后原代培养小鼠肝细胞中IP／Westernblot法能检测到全长HBx蛋白及其羧基端截短体HBxl。101、氨基端截短体HBx43以54的表达，全长HBx与硒X43J54的表达水平相当，而HBx卜101的表达水平明显低于前两者。全长HBx与HBx43。54能下调p16的表达水平，上调p21、cyclinD、cyclinE的表达水平，对cyclinA的表达水平无影响，HBx卜101对上述细胞周期标志物的表达水平均无影响。在增加pSI．HA．X卜101质粒转染量以提高HBx卜10

7、1蛋白表达水平之后，对细胞周期标志物的表达仍无影响。(3)与pGEM—HBVAX组细胞相比，pGEM-HBV组细胞内p16的表达下调，p21、cyclinD、cyclinE的表达上调，cyclinA的表达水平无明显变化，且核心颗粒HBVDNA水平明显高于pGEM．HBVAX组细胞。分别以全长HBx和HBx43。154重建pGEM-HBVAX缺失的HBx蛋白表达之后，其各项细胞周期标志物的表达和核心颗粒HBVDNA均能够恢复到与pGEM．HBV组细胞相似的水平，但即使增加pSI．HA．X卜101质粒转染量以使HBxl。101蛋白表达水平与全长HB

8、x和HBx43‘154相当，pGEM-HBVAX组细胞内细胞周期标志物的水平和核心颗粒HBVDNA水平仍然没有明显改变。HBV编码的HBc蛋白水平在各