HBV HBx基因荧光真核表达质粒的构建及其运用于HBV复制机制的初步研究-论文.pdf

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1、安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2013Nov；48(11)·1297·HBVHBx基因荧光真核表达质粒的构建及其运用于HBV复制机制的初步研究杨凯，管世鹤，孙蓓蓓，潘颖，吴园园，王爱华摘要目的构建能够表达HBx蛋白的绿色增强荧光蛋白一1材料与方法HBx(pEGFP—N1一HBx)真核表达质粒，并探讨HBx蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法以HBVDimer为模1．1材料来源HepG2细胞由德国埃森大学陆蒙板，PCR法扩增HBx基因，PCR产物测序分析正确后克隆至吉教授惠赠，细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养真核表达载体pEGFP

2、—N1，命名为pEGFP—N1一HBx。将该质粒液常规传代培养。质粒pEGFP-N1购自美国Clon—转染肝胚瘤细胞株HepG2，以RT—PCR法及荧光显微镜观察tech公司；质粒HBVDimer、pHBV48．X0分别由德国其表达情况，再通过基因共转染等技术研究HBx蛋白对埃森大学陆蒙吉教授和台湾大学Ding—ShinnChenHBV复制的影响。结果酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含HBx基因，RT—PCR法检测和荧光显微镜观察表明构建教授惠赠。Lipofectamine2000购自美国Invitrogen的pEGFP—N1一HBx质粒在HepG2细胞中能够表达；质粒公司；荧光定量PCR检测

3、试剂盒购自上海克隆公pEGFP—N1一HBx与pHBV48一X0共转染后，HepG2细胞上清液司；ELISA试剂盒购自上海长征复星公司。HBV—DNA、HBsAg和HBeAg分泌显著增多。结论HBx基1．2pEGFP-N1-HBx质粒构建根据HBV全因克隆及其真核表达载体pEGFP—N1一HBx构建成功；HBx蛋DNA序列(ayw亚型)(GenBank2182117)运用白能够促进HBV复制及抗原分泌。primerpremier5．0软件设计HBx序列引物，上游引关键词乙型肝炎病毒；HBx蛋白；质粒；复制物HBxFH：5一CCATGGCTGCTAGGCTGTG．3；下游中图分类号R373．2

4、；R512．6；Q343．3弓I物HBxRB：5一AGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC一3。文献标志码A文章编号1000—1492(2013)11—1297—03HBxFH和HBxRB的5端分别引人EcoRI(GAAT—TC)、BamHI(GGATCC)的酶切位点。反应条件：乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染肝95℃预变性240S，95℃变性30S，55cC退火30S，细胞后，能引起慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等72℃延伸420S。PCR产物在2％琼脂糖凝胶电泳疾病I2J。在HBV基因组编码的众多病毒蛋白中，鉴定大小。PCR纯化回收产物9Ixl，T载体1txl

5、，HBx蛋白是一种多功能蛋白，能与宿主细胞发生相solutionI10l，4cC连接过夜。全量转入感受态大互作用，通过调控宿主细胞遗传物质转录、与蛋白直肠杆菌DH5a中，涂于含氨苄青霉素的培养板中，置接作用或诱导蛋白降解而影响靶蛋白功能，进而在于37℃孵箱中过夜培养。挑取5个单克隆菌落小HBV感染致病及HBV相关性肝癌发生发展中起到量扩菌，用质粒抽提试剂盒提取质粒，取质粒8l、重要作用J。该研究通过构建增强型绿色荧光蛋EcoR10．5l、BamH10．5ixl，10xHBuffer1Ixl，白．HBx基因(pEGFP—N1．HBx)荧光真核表达质粒，37℃小量酶切2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，得

6、到与T以基因共转染技术转染pEGFP—N1一HBx与pHBV48-载体连接产物。空载体pEGFP．N1双酶切，纯化回X0至HepG2细胞，依据细胞外HBV—DNA和HBV收凝胶产物。pEGFP-N13txl、与T载体连接产物抗原的表达量来探讨HBx蛋白对HBV复制的影13Ixl、T4DNA连接酶2l、buffer2Ixl，总体系2Ol响，为揭示HBV在肝细胞内复制机制提供一定的实于4℃连接过夜，全量转入DH5a中，涂于含卡那霉验依据。素的培养板中，过夜培养。挑取阳性克隆抽提质粒，2013—05—31接收双酶切、PCR鉴定，DNA测序，得到pEGFP—N1．HBx基金项目：国家自然科学基金(编

7、号：81171662)；安徽省教育厅基金真核表达质粒。(编号：KJ2012Z163)；安徽医科大学校级科研基金(编1．3质粒转染HepG2细胞以6×10／ml接种6号：2011XKJ049)孔板，每孔1ml。接种后第2天待细胞汇合约为作者单位：安徽医科大学第二附属医院检验科，合肥23060175％时，混合pEGFP—N1-HBx、pHBV48．X0与Lipo—作者简介：杨凯，男，检验技师；管世鹤，男，教授，主