ttv核酸模板快速制备方法论文

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1、TTV核酸模板快速制备方法论文.freelittedvirusnucleicacidtemplateSUMing-Quan1，FENGJi-Hong2，YUAYue-Yun1，ZHANGJian-Fang1，ZHANGLin1，LIUJia-Yun11CenterofClinicalMolecularBiology，XijingHospi-tal，FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi'an710033，China，2DeparmentofInfectiousDiseases，CollegeofMed

2、icine，Yan'anUniversity，Yan'an716000Keyittedvirus;polymerasechainreaction;DNApreparationAbstract:AIMToestablishamethodadaptingtorapidpreparationofTTVDNAfrombulksamplesforPCR.METHODSTTVnucleicacidtemplateethods，viz.hydroxybenzenechloro-formextractionanddirectlyrapidcrac

3、king.RESULTSDNAabstractedbythetethodsplifiedatsamePCRparameterandthecoincidencerateainlaboratorydiagnosismethodistodetectit'sDNAbyPCR，soitisveryimportanttoestablishamethodforrapidpreparationofTTVDNAfrombulksamples.0引言TT病毒是近年新发现的一种肝炎病毒，当发现一种新的病原性相关病毒因子时，建立一种敏感、快速、特异的实验

4、室检测方法并评价该病毒因子在肝病中的价值是十分重要的，该方法的临床适用性和可行性，是评价所建立方法在临床上应用价值的关键所在.目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据，建立具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法，对TTV肝炎的快速诊断，具有重要的意义.我们从临床快速检测需要为目的，寻求建立一种快速、简便的TTV核酸制备方法，用于大批量临床标本的检测，获得满意的结果.1材料和方法1.1材料非甲～非庚型肝炎血清30例，来自延安大学医学院传染科;慢性乙型肝炎患者血清50例，来自西京医院就诊患者;引物及合成:根据Nis

5、hizamolL-1Tris-HClpH8.0，200mmolL-1NaCl，10mmolL-1EDTA，20gL-1SDS，1gL-1蛋白酶K），60℃水浴60min，加等体积酚:氯仿:异戊醇（25∶24∶1）混匀，4℃冰浴下30min，2000g离心10min，取上清加等体积预冷无水乙醇-20℃过夜，1000g离心20min，沉淀溶于20μL0.1×TE缓冲液中，备用.②直接快速制备法:20μL血清加50μL快速裂解液（50mmolL-1TrisHCl，pH8.0，50mmolL1KCl，1.5mmolL-1MgCl，10gL

6、-1NP-40，5gL-1Tin，1000g离心10min，取上清做模板.③PCR扩增:第1轮PCR扩增:总反应体积为25μL，包括:10×PCR缓冲液2.5μL;4×dNTP2.0μL;外引物各1.0μL（50pmolL-1）;DNA模板5.0μL;TaqDNA酶3UμL-1;无菌蒸馏水12.5μL;无菌石蜡油30μL覆盖液面，94℃变性3min，进入PCR循环，循环条件:94℃50s，55℃50s，72℃70s，32个循环，最后72℃延伸5min.第2轮PCR扩增:总反应体积为25μL，包括:10×PCR缓冲液2.5μL;4×

7、dNTP2.0μL;内引物各1.0μL（50pmolL-1）;第1次PCR产物5.0μL;TaqDNA酶1.5UμL-1;无菌蒸馏水12.5μL;无菌石蜡油30μL覆盖液面，94℃变性3min，进入PCR循环，循环条件:94℃50s，55℃50s，72℃70s，32个循环，最后72℃延伸5min.④产物检测:取15μL第2次PCR扩增产物，于20gL-1琼脂糖（含EB）凝胶中，电泳100V30min，紫外灯下观察结果，出现196bp片段者为TTV阳性.2结果2.130份非甲～非庚型肝炎2种TTV核酸制备方法检测结果采用巢式聚合酶链

8、反应（nest-PCR），对2种方法分别制备的TTV核酸为模板进行扩增，结果在30份血清中2种制备方法均同时检测出6份为TTV阳性，二者符合率为100%.2.250份慢性乙型肝炎2种TTV核酸制备方法检测结果采用巢式聚合酶链反应（nest-PCR）