对山东地区ttv基因片段的检测及其部分核酸序列测定

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1、对山东地区TTV基因片段的检测及其部分核酸序列测定摘要:目的了解山东地区输血传播病毒（TTV）分离株感染状况及基因变异的情况.方法应用逆转录―聚合酶链反应法（RT-PCR）检测山东地区26例非甲～戊型肝炎和12例肝细胞癌患者血清中的TTVDNA，对阳性扩增的产物进行测序，并分析其基因变异情况.结果26例非甲～戊型肝炎患者检出TTVDNA阳性者11例（42%）.对其中2例（TTVSD4，TTVSD5）进行PCR产物直接测序，并与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性分别为99.9%和100%.而12例肝细胞癌患者中TTVDNA阳性3例（25%），对其中1例（TT

2、VSD6）测序，与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性为99%;TTVSD4、TTVSD5和TTVSD6之间的核苷酸同源性均为99%.结论山东地区非甲～戊型肝炎和肝细胞癌患者中TTV感染率较高，测序结果表明其与日本株（AB008394）有较高的同源性.Keyittedvirus;nonA-Ehepatitis;Nucleotidesequence　　Abstract:AIMToinvestigatetheprevalenceofTTVinfec-tionandgeicvariationofTTVisolateinShandongProvince.METHOD

3、STTVDNAplifiedandde-tectedbyRT-PCRmethodsfromseraofpatientsa（n=12）.ThepositivePCRproducts（TTVSD4，TTVSD5）ologya.Oneofthem（TTVSD6）ologyapatientsinShandongprovince.ThesecquenceresultsshoologyL，分离血清，分装后置-80℃冰柜保存备用，采血同时进行流行病学调查.　　1.2方法　　1.2.1TTVDNA提取取血清100μL加300μL裂解液［13.3mmolL-1Tris-HCL，pH8.0，6

4、.7mmolL-1乙二胺四乙酸（EDTA），6.7gL-1十二烷基硫酸钠（SDS），133mgL-1蛋白酶K］.70℃水浴1h，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于20μL1×TE中.　　1.2.2PCR扩增参照TTV日本株序列设计2套引物，由上海生工生物工程有限公司合成.分别为:S1:5’-CCATTCACAGACAGAGGAGAAGGC-3’，S2:5’-CTAATAAGAAGTCCCTTTACAGACCC-3’，AS1:5’-GGAGTGGGTTTCGGGGCAGGG-3’，其中，S1/AS1为外引物，S2/AS1为内引物，预期扩增片段为323bp;S3:5’-CAATA

5、GAGTCCCTAGAA-GCTTACA-3’，AS3:5’-GGTAACAAG-GTAGGGTTGATATC-3’，S4:5’-GGAACTCA-CATTCCATACCTG-3’，AS4:5’-GTTTGACTC-CCAGGATTCG-3’，其中S3/AS3为外引物，S4/AS4为内引物，预期扩增片段为329bp.PCR试剂购自Progema公司.PCR扩增条件:取模板5μL，10×Taq缓冲液5μL，dNTP0.1mmolL-1和Taq酶1U，引物浓度均为0.3μmolL-1，共50μL反应体积;取第1次PCR产物5μL作模板，其他同第1轮.循环条件均为:94℃预变性1

6、80s，94℃35s，56℃35s，72℃45s，扩增30个循环，72℃延伸8min.取第2次PCR产物15μL20gL-1琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果.　　1.2.3序列测定和分析PCR产物纯化后用PE公司的ABIPrism377DNA自动测序仪行PCR产物直接测序，测序引物为S4/AS4，将所测序列通过In-terBlast进行同源性分析.　　2结果　　26例非甲～庚肝炎和12例肝细胞癌患者血清中TTVDNA阳性检出率分别为24%（11/26）和25%（3/12）.对PCR阳性产物直接测序，InterBlast检索结果表明山东TTVSD4、TTVSD5和TTVS

7、D6与日本TTV原型（基因1a）TA278（AB008394）［1］相应部位核苷酸序列同源性分别为99%、100%和99%，此3株间核苷酸同源性也达99%以上（Fig1）.　　图1略　　3讨论　　1997年，NishizaBN（20U）酶切消化后PCR，同时设立阴阳性对照观察.检测结果表明，26例非甲～戊型肝炎和12例HCC患者血清中，TTVDNA阳性检出率分别为42%（11/26）和25%（3/12）.由此可见山东地区非甲～戊型肝炎患者中确存在TTVDNA，提示TTV可能是导致非甲～戊型肝炎的病原体.由于肝癌患者