rna干扰技术沉默stat3对人肺癌细胞生长抑制的作用

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1、RNA干扰技术沉默STAT3对人肺癌细胞生长抑制的作用作者：孙绍娟，王鸿程，许学亮，孔志斌，简丽萍，曹兵【摘要】目的探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用。方法针对STAT3mRNA序列设计合成2对编码siRNA的DNA模板，构建pSUPERsiRNASTAT3重组质粒，转染A549细胞；采用RTPCR法检测重组质粒对STAT3基因表达的影响；在荧光显微镜下观察细胞的凋亡情况。结果成功构建pSUPERsiRNASTAT3重组质粒，并成功转染A549细胞。特异性siRN

2、A片段能有效降低STAT3mRNA水平，最大干扰效率达85.32％，明显高于空质粒对照组；干扰作用于转染后24h即可出现，48h达高峰，72h降低。对应不同位点的两个siRNA片段对STAT3均可产生干扰作用，彼此间差别不大。在荧光显微镜下，与未转染细胞相比，转染siRNA的A549细胞中凋亡细胞所占比例明显增加。结论pSUPERsiRNASTAT3可抑制STAT3在人肺腺癌A549细胞中的表达，并抑制肿瘤细胞的生长，促进其凋亡。以STAT3为靶点的RNA干扰技术可望成为肺癌基因治疗的新方法。【关键词】肺癌；

3、RNA干扰；STAT3；凋亡　　Abstract：ObjectiveTostudytheeffectsofpSUPERsiRNASTAT3geneonthegroplatecodingsiRNAicroscope.ResultsThesiRNAeukaryoticexpressionvectoragainstSTAT3mRNARNAinA549cellsRNAexpressionbegantoappear24hoursaftertransfection．Andthemostapparentinterferin

4、gefficiencyarkedlyhigherthanthatinthecellstransfecteddifferentlocihadinterferingeffectonSTAT3mRNAexpression，butthere．paredicroscope.ConclusionpSUPERsiRNASTAT3couldsignificantlyinhibitSTAT3expression，suppressthegroayprovideaneethodinthegenetherapyoflungcance

5、r．　　KeyRNA为靶点，在转录后使其沉默，不直接干扰DNA，具有特异、高效、简便快捷和小干扰RNA(siRNA)可在细胞间转移等特点[47]。本实验利用RNAi技术，针对STAT3基因的2个不同部位设计2对siRNA，用带有u6启动子的质粒pSUPER构建siRNASTAT3表达载体，转染人肺腺癌A549细胞，阻抑STAT3基因的过度表达，诱导肿瘤细胞凋亡，初步探讨其作为治疗肺癌新的基因靶位的可行性。　　1材料与方法　　1.1材料siRNA片段:从STAT3基因编码区起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列

6、（9891007核苷酸碱基序列CATCTGCCTAGATCGGCTA与21442162核苷酸碱基序列GCAGCAGCTGAACAACATG），上述序列用BLAST软件进行同源分析证实为STAT3高度保守，采用化学合成法合成。主要试剂：带有u6启动子的质粒载体(pSUPER)及肺腺癌A549细胞均由四川大学华西医院提供，T4DNA连接酶、EcoRII和HindⅢ限制性内切酶、质粒提取试剂盒及RTPCR相关试剂由上海生工提供，E.coliDH5α感受态细胞由大连宝生物公司提供，脂质体(1ipofectamine

7、2000)、Trizol试剂由Invitrogen提供。　　1.2方法　　1.2.1重组质粒pSUPER–siRNA–STAT3的构建及鉴定从GenBank中STAT3mRNA(NM003150)上寻找符合特征的靶序列，合成分别针对其编码区碱基序列的两条DNA寡核苷酸链(分别为STAT31，2，)，设计的寡核苷酸序列5’端和3’端分别含BglII和HindIII酶切位点。5’端开始为19个核苷酸的siRNA作用链序列，中间以9个核苷酸的TTCAAGAGA间隔形成发夹结构，最后为siRNA作用序列的反向重复序列

8、；3’末端加有转录终止信号TTTTT。合成的两条互补寡核苷酸链在退火缓冲液作用下退火，形成双链结构。pSUPER经BglII和HindIII双酶切线性化，在T4DNA连接酶的作用下与退火后形成的双链结构连接，形成pSUPERsiRNASTAT3重组质粒。提取重组质粒进行PCR及测序鉴定。　　1.2.2细胞培养及转染肺腺癌A549细胞1×106个分别接种于100ml培养