RNA干扰技术沉默STAT3基因对肺腺癌A549细胞生长抑制作用的研究——应用FCM检测肺腺癌A549细胞STAT3基因沉默前后细胞周期和细胞凋亡的实验研究

《RNA干扰技术沉默STAT3基因对肺腺癌A549细胞生长抑制作用的研究——应用FCM检测肺腺癌A549细胞STAT3基因沉默前后细胞周期和细胞凋亡的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、RNA干扰技术沉默STAT3基因对肺腺癌A549细胞生长抑制作用的研究——应用FCM检测肺腺癌A549细胞S仉虹3基因沉默前后细胞周期和细胞凋亡的实验研究摘要目的：利用流式细胞仪(FCM)检测RNA干扰技术沉默S玑钮3基因表达前后肺腺癌A549细胞的细胞周期状况和细胞凋亡水平变化，探讨(1)S仉钮3基因表达在肺腺癌A549细胞增殖生长中的作用；(2)STAT3是否介导A549细胞周期的进展；(3)S仉姐3与A549细胞的凋亡是否有密切关系。方法：(1)STAT3siRNA的构建和转染：①从CNKI上搜索人的STAT3mRNA全基因序

2、列，将搜索的所有序列利用BLAST软件进行同源性分析。②将比对好的S仉锶3mRNA全基因序列作为模版，从基因编码区起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列，根据siRNA的设计原则，设计三段表达STAT3特异shRNA的基因序列。⑧按照设计的序列，采用化学合成的方法合成三条双链siI矾A，分别为S仉气T3siRNA．1、S玑气T3siRNA．2、STAT3siRNA．3，同时设立Non．Control阴性对照组，Non．Control—FAM荧光对照组及空白组。④采用脂质体介导方法将siRNA转染A549细胞，并利用荧光显微镜观察转染

3、情况，估计转染效率，筛选最佳转染浓度。(2)AM．BLUE法测定RNA干扰的抑制率：于转染24h、48h、72h分别加入AM．BLUE孵育4．6h，用酶联免疫检测仪检测光吸收值，计算出抑制率。(3)FCM检测STAT3基因沉默前后肺腺癌A549细胞的细胞周期状况和细胞凋亡水平：①于转染24h、48h、72h收集细胞，将细胞固定后，进行PI染色，利用FCM检测细胞周期的变化。②于转染24h、48h、72h收集细胞，利用AnnexinV联合PI法检测细胞的凋亡。结果：(1)成功设计并化学合成siRNA，成功转染A549细胞，并根据转染效

4、率筛选出最佳转染浓度；(2)AM．BLUE法检测结果显示RNA干扰的抑制率于转染后24h即可出现，48h抑制率较24h有明显上升(PO．05)。表明49h后抑制率进入稳定阶段。对应不同靶点的三条STAT3siRNA均可抑制A549细胞增殖，且三者抑制率差别不显著(P>O．05)；(3)利用FCM检测到STAT3siRNA肺腺癌A549细胞大量处于Go／Gl期，而S，G2／M期的细胞相对减少。提示细胞未能进入S期完成DNA的合成，无法进入分裂期，细胞周期被阻断。(4)利用FCM检测R

5、NA干扰后A549细胞凋亡明显增多，前48h增幅明显(P<0．05)，48h后增幅趋于平稳(P>O．05)，但仍能较长时间维持较高水平，干扰各组A549细胞凋亡率无明显差异(P>O．05)。结论：(1)本实验利用基因重组技术，针对STAT3基因编码区，成功合成发夹状小干扰RNA(siRNA)，并将其成功转染入真核细胞中；(2)利用AM—BLUE法检测siRNA干扰前后A549细胞的增殖生长，说明siRNA能有效地抑制A549细胞的增殖生长，STAT3作为治疗肺癌的靶点是可行的，我们选择沉默STAT3的位点是有效的，siRNA的构建是

6、成功的；(3)利用FCM检测siRNA干扰前后A549细胞的细胞周期分布，提示siRNA能阻断A549细胞的细胞周期，使细胞周期停留在G0／G1期，不能进入S期，不能完成DNA的合成，无法进入M期，无法完成细胞的分裂；(4)利用FCM检测siRNA干扰前后A549细胞的凋亡水平变化，表明STAT3siRNA能诱导肺腺癌A549细胞的凋亡，STAT3的表达与A549细胞的凋亡密切相关。关键词：肺腺癌；RNA干扰；STAT3基因；细胞周期；细胞凋亡RNAinterferencesilencingSTAT3geneinlungadenoc

7、arcinomaA549cellgrowthinhibitionstudyApplication———-FCMdetectionoflungadenocarcinomaA549cellsbeforeandaftergenesilencingSTAT3cellcycleandapoptosisinexperimentalresearcn●-lAbstract：bjective：Usingflowcytometry(FCM)detectionofinterferencesilencingSTAT3geneexpressioninlung

8、adenocarcinomaA549cellsbeforeandafterthecellcycleandapoptosisStamsofthelevelofchange，Discussion(1)STAT3geneexpression