shrna沉默tpx2基因对肺腺癌细胞a549凋亡及紫杉醇敏感性的影响

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1、重庆医科大学硕士学位论文shRNA沉默TPX2基因对肺腺癌细胞A549凋亡及紫杉醇敏感性的影响姓名：刘莹申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：张徽201205重庆医科大学硕士研究生学位论文shRNA沉默TPX2基因对肺腺癌细胞A549凋亡及紫杉醇敏感性的影响摘要目的：观察靶向Xklp2靶蛋白(thetargetingproteinforXenopuskinesin-likeprotein2，皿X2)的短发夹状RNA(shonhai叩inRNA，shRNA)对肺腺癌A549细胞的凋亡率及其对化疗药物敏感性的影响。方法：以肺腺癌A549细胞做为实验的研究对象。构建

2、特异性靶向TPX2基因的干扰载体sIlI矾A—TPX2，经Lipofectamine2000介导将shRNA．皿X2干扰载体转染进入A549细胞，并进行筛选及克隆化培养。逆转录RCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)及蛋白质印迹法(W．estemblo仕ing)分别检测转染干扰载体前后细胞中皿X2基因mRNA和蛋白表达水平的变化。细胞凋亡率及细胞周期的变化用流式细胞术检测。MTT比色法用于检测对化疗药物敏感性的变化。RT-PCR检测Aurora-A，P53，Bcl一2，肺耐药蛋白(1ungresistanceprotein，LRP)及多药耐药相

3、关蛋白(multidrugresistance—associatedprotein，MRP)mRNA表达水平的变化。结果：RT-PCR及Westemblotting结果显示，shRNA-TPX2重组质粒能使A549细胞中TPX2向斛A及蛋白表达水平明显降低；流式细胞术结果显示转染组的细胞凋亡率明显增高且阻滞在细胞周期S期：MTT比色法结果显示转染了重组质粒s拙NA．TPx2的A549细胞对化2重庆医科大学硕士研究生学位论文疗药物紫杉醇的敏感性明显增加；RT-PCR检测相关基因显示P53mRNA表达水平升高，Aurora—A，Bcl．2m砌叮A表达水平降低。以上实验结果经统计

4、学分析与阴性对照组，空白对照组相比差异具有统计学意义(PO．05)。结论：重组质粒能在核酸水平和蛋白水平上有效的抑制肺腺癌细胞系A549中TPX2基因的表达。并且促进细胞的凋亡，增加其对化疗药物紫杉醇的敏感性。该作用可能与呻X2基因被抑制后，其下游P53表达水平上调，Bcl．2表达水平下调有关。关键词：TPx2基因；短发夹RNA；肺腺癌；凋亡；药物敏感性EFFECTSOFSHRNATARGETINGTPX2ONTHEAPOPTOTICRATEANDSENSITIVITYTOPACLITAXEL

5、OFA549CELLSABSTRACTObjective：Tostudythee圩ectofshorthai叩in心n(sl心A)targetedⅢ，X2on印optosisandsensitiV毋topaclitaxelofLungAdenocarcin撇aA549cells．Method：shRNA．TPX2expressionvectorconstructedandconfill：Iledbysequencing，wastransfectedintoA549cellsusinglipofect锄ine2000andG418wasselectedandcloned．Th

6、eeXpressionleVelsofTPX2mRNAandproteinweredetectedbyRT-PCRandW．estemblotting，cellcyCleand印optoticratewereanalyzedbyFlowcytometⅨsensitiVi够topaClitaxelinA549weredeteminedbyMTTaSsay．TheleVelsofAurora-A，P53，Bcl-2，LRPaIldNⅡ冲n删AweredetectedbyRT-PCR．Results：AftershRNA．TPX2expressionVectortransfect

7、ion，Rr-PCRandW．estemblottingassaysshowedthattherewasasignificantdecreaseinTPX2mRNAa11dproteinlevels．F10wc"ometr)，showedthatthecellsm勾orstagnativestayedinthephasesandtheapoptoticrateincreasedobViously．ThedifferencewaSsignificantcomp2uredwitllcontrolgroup(P