的应用rna干扰技术沉默e2f3基因对膀胱癌生长抑制作用

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1、天津医科大学博士学位论文应用RNA干扰技术沉默E2F3基因对膀胱癌的生长抑制作用姓名：胡海龙申请学位级别：博士专业：外科学（泌尿外）指导教师：韩瑞发;张文岚20070501中文摘要膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，大约70％的患者初诊时为浅表性膀胱癌，30％为浸润性膀胱肿瘤。膀胱癌的恶性生物学特性包括：多灶性、多基因参与、多阶段异质性生长。膀胱癌目前的治疗主要包括手术和术后膀胱腔内灌注抗癌药物，然而手术后易复发和对化疗药物的高度耐药性等相关问题一直是基础与临床研究的重点课题，人类也一直在探索更为有效的膀胱癌治疗方法。基因治

2、疗经过近20多年的发展已被认为是继手术、化疗等常规治疗方法之后极有希望根治膀胱癌的方法。但有效的基因治疗靶点及基因治疗方法的选择成为基因治疗应用于临床的最大障碍。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)的发现为我们快速、准确的研究基因的功能、寻找基因治疗的靶点带来了希望，同时治疗性的基因沉默技术作为一种基因治疗的手段也拥有巨大的潜力。RNAi是一种非常保守的基因沉默机制。在原始生物中RNAi能够保护基因组免受病毒或者其它基因片段的插入，并且在生物的发育过程调节众多基因的表达。短的双链RNA中的反义链与RNA沉

3、默诱导复合物相结合后能够与同源的mRNA序列特异性的结合，导致mRNA切割断裂及随后出现的转录后水平基因表达的抑制。尽管我们现在对RNAi的分子机制及RNAi是如何调节基因表达方面的了解还仅仅是冰山一角，但RN砧为我们提供了治疗肿瘤的新方案及新思路。肿瘤的发生与发展与细胞周期调节失控密切相关。E2F3是细胞周期调控过程中起核心作用的转录因子，其控制着细胞增殖过程(DNA复制及细胞周期调控1中众多基因的表达。E2F3具有很高的转录激活能力，它是细胞周期由静止期进入S期所必需的转录因子。E2F3与视网膜母细胞瘤蛋I!t(Ret

4、inoblastomaprotein．pC,J3)关系密切，在人类的众多肿瘤中都存在Rb基因的失活，丽具有生长抑制特点的pRB的主要功能就是通过对E2F的调节而起作用的。为了探索E2F3在细胞周期调控过程中是否起关键作用，其是否可以作为膀胱癌基因治疗的新靶点，应用RNAi的方法以E2f3基因为基因治疗的靶点进行膀胱癌基因治疗能否有效的抑制肿瘤细胞的增殖?为了科学的回答上述问题，本文进行了以下实验研究：①研究膀胱癌不同分级组织中的E2F3及其相关调控蛋白的表达；分析E2F3在膀胱癌发生与发展中的作用；②应用RNAi技术研究人

5、膀胱癌细胞株5637、T24转染针对E2F3基因的重组干扰质粒后E2F3基因转录水平和E2F3蛋白表达的变化：观察siRNA对5637、T24细胞细胞周期、凋亡及增殖的影响；③研究重组干扰质粒对膀胱癌裸鼠移植瘤模型的治疗效果，为膀胱癌基因治疗提供新的治疗靶点和新的理论依据。第一部分膀胱移行癌组织中E2F3、C．myc及Be92的表达及其与膀胱癌的关系目的：本部分探讨膀胱移行细胞癌(Bladdertransitionalcellcarcinoma，BTCC)组织及正常膀胱粘膜组织中E2F3基因及其下游相关基因C．myc和Bc

6、l．2的表达情况，同时分析E2F3、C．myc和Bcl一2的表达与临床病理参数之间的关系及三个指标之间的相关性，初步揭示BTCC发生、发展的分子机制，为后续的以E2f3基因为靶点的基因治疗体外、体内实验研究奠定理论基础。方法：应用免疫组织化学方法检测不同病理分期及组织分级的BTCC标本和正常膀胱粘膜中E2F3、C-myc与Bcl．2蛋白的表达情况，应用免疫组化自动分析系统进行分析，结果以积分光密度(integratedopucaldensivy，IOD)表示；应用RT-PcR的方法半定量分析E2F3mRNA在不同组织中的表

7、达情况，探讨BTCC组织中E2F3、C—mye与Bcl．2蛋白的表达之间的关系及三者与临床病理参数之间的关系。结果：免疫组织化学结果显示，E2F3表达阳性率在膀胱移行细胞癌中为32．8％，而正常膀胱粘膜组织E2F3无表达，两组间差异有显著性(P

8、达与病理分级、组织分期有关泸<0．01)，Bcl-2的表达率只与病理分级密切相关(尸